404 Глава 14

дом пертурбации растворителем, как в примере 14-Е, показыва­ет, что на поверхности белка находятся 4 триптофановых остатка (т. е. пертурбации может подвергаться некоторая часть из из­вестного числа триптофановых остатков); если изучить фермент- субстратный комплекс, то выясняется, что только три триптофа­новых остатка находятся на поверхности. Следовательно, когда добавлен субстрат, один триптофан теряет контакт с растворите­лем. Это можно снова интерпретировать как доказательство при­сутствия триптофана в активном центре. Значение этого неслож­ного оптического анализа состоит в том, что он осуществляется в растворе и, следовательно, подтверждает, что структура, опре­деленная с помощью рентгеноструктурного анализа (на сухих образцах), а именно наличие в молекуле полости, в которой на­ходится триптофан и происходит связывание субстрата, вероят­но, сохраняется для лизоцима и в растворе.

Во многих случаях поглощение хромофоров фермента, суб­страта или их обоих меняется в процессе комплексообразования. Следовательно, спектральный анализ (имеется в виду изучение Дє как функции концентрации субстрата или фермента) можно использовать для определения констант диссоциации. Это дейст­вительно очень полезный метод, применимый к исследованию связывания с белком любых веществ (например, небольших молекул или ионов металлов) во всех случаях, когда наблюда­ются изменения в спектре.

Пример 14-И. Ассоциация белка. Изменения спектров в про­цессе ассоциации белка могут быть вызваны следующими при­чинами: либо хромофоры, находившиеся на поверхности, попали в участок связывания и стали недоступны растворителю, либо произошла конформационная перестройка, в результате которой хромофор стал недоступным или доступным, но в другой части молекулы. Следовательно, как в примере 14-3, по спектральным изменениям можно контролировать наличие взаимодействия мо­лекул белка и посредством этого определять условия, кинетику этого процесса и т. д. (рис. 14-20).

РИС. 14-21.

Две из нескольких возможных структур дрожжевой аланиновой тРНК, по­строенных таким образом, что большая часть оснований участвует в образо­вании водородных связей. Водородная связь пары GC обозначена сплошной линией, пары A-U — точками, более слабые водородные связи, найденные для других пар оснований, обозначены волнообразной линией. Определение числа пар оснований различного типа по данным ЯМР показывает, что правильной является структура клеверного листа (слева).

Принятые обозначения: G — гуанозин; С — цитидин; А — аденозин; U — уридин; I — ино­зин; H₂U — дигидроуридин; Т — рибозилтимин; MG — метилгуанозин; M₂G — диметил- гуанозин; Ч^г — псевдоуридин; MI — метилинозин. [Последовательность оснований описана ЯоЧу R. W., Apgar 1., Everett G. A., Madison J. Т., Marquisee М., Merill S. H., Fens- wick I. R., Zamer A., Scionce, 147, 1462—1465 (1965).]

Этот процесс можно изучать с помощью дифференциальной спектроскопии; в этом случае для получения дифференциального спектра используют два раствора, которые идентичны во всем, кроме концентрации.

Пример 14-К. Пертурбация растворителем нуклеиновых кис­лот. Замена воды на 50%-ную Ъ₂0 приводит к характерным из­менениям в спектрах мононуклеотидов, но не оказывает влияния на спектры пар оснований. Таким образом, изменения в спектре НК в 50%-ной D₂0 можно использовать для определения доли ■оснований, которые не участвуют в образовании пар. Это особен­но важно при изучении таких молекул, как транспортная РНК (тРНК). В тРНК последовательность оснований такова, что не все они образуют водородные связи; можно построить простран­ственные модели, в которых реализуется часть водородных свя­зей (рис. 14-21). Согласно различным моделям, требуется, чтобы разное число оснований было связано водородными связями; спектральные данные позволяют исключить некоторые возмож-