402 Глава 14

раствора белка в воде относительно раствора белка в 20%-ном этиленгликоле, имеется пик при 292 нм. Количество триптофана в образце может быть определено из D_2So и егво, измеренных в Н₂0; а из ЛЄ292 Для свободного триптофана в воде и в 20%-ном этиленгликоле известна ожидаемая AD₂9₂ для образца при усло­вии, что призошла пертурбация всех триптофановых остатков. Допустим, что эта величина равняется 1,00. Если же для этого белка измерить Д-Огэг, то она будет составлять 0,6. Так как пертурбации подвергаются только те остатки, которые располо­жены на поверхности, то их число 0,6/1,00-5 = 3. Если известна аминокислотная последовательность белка, с помощью простого приема можно идентифицировать отдельные триптофановые ос­татки, которые находятся на поверхности. При обработке белка различными окислителями, индольная группа триптофана окис­ляется и перестает поглощать. Преимущественно будут окис­ляться только те триптофановые остатки, которые находятся на поверхности; но это необходимо проверять. Это тоже может быть сделано с помощью метода пертурбации растворителем и дифференциальной спектроскопии. Если Д1>292 = 0 после окисле­ния, окисленные триптофановые остатки должны быть на по­верхности. Убедившись в этом, можно заново определить после­довательность аминокислот в окисленном белке и отметить поло­жение окисленных триптофановых остатков. Следовательно, могут быть идентифицированы отдельные триптофановые остат­ки, находящиеся на поверхности. Такого рода информация помо­гает при установлении пространственной структуры молекулы и часто служит отправной точкой для рентгеноструктурного ана­лиза.

В предыдущем примере величина AD292, которую можно было ожидать, если бы все триптофановые остатки находились на по­верхности, была рассчитана из величин оптической плотности и молярного коэффициента погашения чистого белка в отсутствие пертурбанта. Такой расчет невозможен, если в образце белка содержатся поглощающие примеси. Однако измерение можно сделать другим путем, воспользовавшись тем, что, если белок денатурировал, все аминокислоты находятся в контакте с раст­ворителем. Следовательно, максимальное значение AZ)292 можно определить из дифференциального спектра денатурированного белка в растворителе-пертурбанте против нативного белка в по­лярном растворителе.

До сих пор мы пытались отличить внешние аминокислоты от внутренних. Однако это различие не всегда отчетливо, поскольку в некоторых случаях хромофор не спрятан полностью, а нахо­дится в глубокой полости. При этом воздействовать на его спектр можно только в том случае, если молекулы пертурбанта меньше некоторого критического размера и могут попасть в по-

РИС. 14-19.

Изучение перехода спираль-клубок в гипотетиче­ском белке методом пертурбационной дифферен­циальной спектроскопии в 20%-ном водном рас­творе этиленгликоля, содержащем NaCl в двух различных концентрациях.

Измерения ведутся при одной длине волны. Раствором сравнения для получения дифференциального спектра служит раствор белка в этиленгликоле, содержащем NaCl, при 20°С. Отметим, что этот белок более устойчив при больших концентрациях NaCl, так как в 0,1 М NaCl он разворачивается при более высоких температурах.

АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 403