Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
382 ГЛАВА 13.doc
Скачиваний:
0
Добавлен:
01.07.2025
Размер:
311.3 Кб
Скачать

НЖ,. 14-u.

Схематическое устройство спектрофотометра.

Свет от лампы 1 проходит через монохроматор 2 для выделения пучка света с опреде­ленной длиной волны. Образец 3 и растворитель 4 содержатся в двух кюветах, поме­щенных в держатель кювет 5. Свет проходит через кювету и падает на фотоэлемент 6, выходной сигнал которого регистрируется измерительным прибором 7. Держатель кюветы находится на направляющих 8, так что каждая кювета может быть независимо помещена в пучок лучей.

дующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через растворитель (который может быть буфером), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через 'раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фик­сируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. На практике при­бор настраивают таким образом, чтобы он показывал нулевое поглощение при измерении одного растворителя (это называется настройкой прибора на нуль). Осуществив такую настройку, можно снимать показания, соответствующие непосредственно по­глощению образца. Для получения спектра эта операция повто­ряется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называе­мые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектро­фотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся в различных кюветах) и фиксировать с по­мощью электронного оборудования суммированный поток излу­чений. При этом на самописце вычерчивается спектр. Эти при­боры очень дорогие, но они оправдывают себя при проведении большого количества спектральных анализов.

Параметры, измеряемые в абсорбционной спектроскопии

На рис. 14-6 показаны спектры, снятые в видимой и УФ-областях для двух биологических молекул. Обычно определяются величи­ны D или ε. Длина волны, соответствующая максимуму погло-

388 Глава 14

АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 389

ЩЄНИЯ, называется λмакс, и именно при этой длине волны обычно определяют ε. Некоторые полосы поглощения состоят из много­численных пиков, и часто регистрируют длины волн, соответст­вующие пикам, имеющим меньшие молярные коэффициенты по­гашения. Эти длины волн иногда также называют макс или ука­зывают, ЧТО вещество имеет максимумы поглощения при λ1, λ2... ...λn,

Иногда измеряют ширину полосы, хотя и не обязательно.

В табл. 14-1 * Приведен СПИСОК величин λмакс и е хромофоров, часто встречающихся в биологических объектах.

ТАБЛИЦА 14-1

Максимумы поглощения λмакс и молярные коэффициенты погашения е различных веществ при нейтральных значениях pH, используемых для биологических исследований

  • Отметим, что длина волны выражается в нанометрах (нм). В более ранней литературе, а иногда и сейчас используют миллимикроны (ммк). Не­которые старые приборы прокалиброваны в ангстремах (А). 1 нм =1 ммк= = 10А=10-9 м.

Рис. 14-6.

Сравнение спектров поглоще­ния двух биологических моле­кул: флавинмононуклеотида

(а) и фикоцианина (б). Спект­ры можно использовать для идентификации соединения.

390 Глава 14

Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора

Спектр поглощения хромофора определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако λмакс и ε претерпева­ют заметные изменения и под влиянием окружения. Имеется в виду влияние pH, полярности растворителя или соседних моле­кул и относительная ориентация соседних хромофоров. Именно эти факторы лежат в основе использования абсорбционной спек­троскопии для характеристики макромолекул.

Влияние окружения состоит в следующем.

Эффект pH. pH раствора определяет ионную форму иони­зуемых хромофоров. На рис. 14-7 показан пример, иллюстри­рующий влияние pH на спектр тирозина.

Эффект полярности. В случае полярных хромофоров часто справедливо (особенно если молекула содержит О, N или S), что λмакс наблюдается при более коротких длинах волн в полярных растворителях, содержащих гидроксил (Н2О, спиртах), чем в неполярных. Пример приведен на рис. 14-8.

Эффекты ориентации. Величины λмакс и є существенно зави­сят от геометрических особенностей молекул. Наиболее известна гипохромия нуклеиновых кислот, т. е. понижение коэффициента погашения нуклеотида, при условии, что нуклеотид входит в со­став одноцепочечного полинуклеотида, в котором нуклеиновые основания сближены и расположены друг над другом. Дальней-

РИС. 14-7.

Спектр поглощения тирозина при pH 6 и 13. Отметим, что, как λмакс, так и ε возрастают при диссоциации ОН-группы фе­нольного остатка.

РИС. 14-8.

Влияние полярности растворителя на спектр поглощения тирозина.

Растворители: вода (сплошная линия) и 20%-ный этиленгликоль (штриховая линия). Отчетливо видно возрастание λмакс в менее полярном растворителе.

РИС. 14-9.

Спектры поглощения ДНК фага Т7 в двухцепочеч­ной (1) и одноцепочечной (2) формах, а также пос­ле гидролиза до свободных нуклеотидов (■?), пока­зывающие понижение оптической плотности (гипо- хромию), которое сопровождает образование более упорядоченной структуры. Спектры получены при одинаковой концентрации.

АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 391

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]