Глава 15

Флуоресцентная спектроскопия

Как было показано в предыдущей главе, спектры поглощения позволяют получать различного рода информацию о свойствах макромолекул и их взаимодействиях с другими молекулами. Воз­можность получения такой информации основана на том, что спектр поглощения молекулы, содержащей хромофор, в значи­тельной степени зависит от ее химического и внешнего окруже­ния. В этой главе будет рассмотрен более чувствительный спект­роскопический метод — флуоресценция.

В случае некоторых молекул поглощение фотона сопровож­дается испусканием света с большей длиной волны (т. е. меньшей энергией). Испускание света называется флуоресценцией (или фосфоресценцией, если свечение долгоживущее). Спектры флуо­ресценции еще в большей степени, чем спектры поглощения, зави­сят от окружения. Для надежной регистрации параметров флуо­ресценции требуются меньшие количества вещества. В связи с этим использование флуоресцентной спектроскопии часто дает определенные преимущества по сравнению с измерением погло­щения (хотя техника получения абсорбционных спектров более проста). Путем измерения флуоресценции можно получить све­дения о конформации, местах связывания, взаимодействиях с растворителем, степени гибкости, межмолекулярных расстояниях и коэффициентах вращательной диффузии макромолекул. К тому же флуоресценцию можно использовать для локализации в жи­вых клетках тех веществ, которые невозможно обнаружить дру­гими методами.

Теория флуоресценции, как и других физических методов, по­ка еще не всегда позволяет провести однозначную корреляцию между флуоресцентными характеристиками и свойствами непо­средственного окружения излучателя; следовательно, и на этот раз возможность применения метода определяют эмпирические правила, полученные путем исследования модельных соединений.

Общая теория флуоресценции

Как было показано в гл. 14, молекула может иметь только диск­ретные величины энергии. Уровни потенциальной энергии моле­кулы описываются схемой энергетических уровней (рис. 15-1). На рисунке показаны два электронных уровня: нижний, или ос-

Кюветы проходят через сухо-воздушный термостат, где подогре­ваются. По достижении требуемой температуры специальными поршневыми микродозаторами добавляются реагенты-инициа- торы реакции, после чего содержимое кювет перемешивается путем вращения. Во время протекания реакции раствор фото- метрируется и происходит запись ферментативной активности анализируемой сыворотки.

Результаты представляются в форме записи на диаграмме, для чего к анализатору подключается самописец.

Некоторые технические данные: точность: 0,0025 ед. оптич. плотности, температура нагрева в термостате +35° ±0,2° С, кюветы из полистирола, цилиндрические, диаметр — 10 ±0,05 мм. Время измерения — от 1 до 9 мин. Дозаторы-насосы для реа­гентов подают от 25 до 250 мкл, ступенями по 25 мкл. Габа­ритные размеры: высота — 250 мм, длина — 730 мм, ширина — 460 мм. Масса — 40 кг.

Другой прибор — скоростной вычисляющий абсорбциометр (фотометр) — автоматизированный прибор, выпускаемый той же фирмой,— предназначен для измерений концентраций компо­нентов крови по 10 видам анализов: общего белка, альбуминов, щелочной фосфатазы, неорганического фосфора, железа, сыво­ротки, холестерина, билирубина, креатинина, гемоглобина.

В приборе имеется 10 измерительных каналов, снабженных интерференционными фильтрами. До начала измерений для каждого вида анализа выбирают соответствующий интерферен­ционный фильтр, калибруют стандартной пробой известной кон­центрации и устанавливают фактор пересчета и номер вида анализа.

Пробы подготавливают непосредственно в кюветах, которые должны вставляться в кодированные штативы. После нажатия кнопки штативы продвигаются через прибор. Измерение и вы­числение происходит автоматически. В результате на цифро­вом табло появляются числовые значения в единицах адсорб­ции или в единицах концентрации и номер пробирки. При под­ключении печатающего устройства эти величины фиксируются на бумажной ленте.

Некоторые технические данные прибора: спектральная об­ласть измерений — 400—700 нм. Точность фотометрических из­мерений: ±0,002—±0,008 ед. оптич. плотности. Кюветы: из по­листирола или стекла, диаметром 10±0,05 мм. Объем жидкости для измерения — 0,7—3,6 мл. Скорость измерения—-20 проб в минуту. Габаритные размеры: высота — 250 мм, длина — 680 мм, ширина — 480 мм. Масса — 50 кг.

Сравнение фотоколориметров по точности показаний можно осуществить, сопоставив допускаемые погрешности показаний по шкалам светопропускания для приборов разных типов. Для отечественных фотоколориметров существует деление на классы, причем для прибора с погрешностью показаний ±1% ¹¹²