частоты, с которым мы встречаемся при флуоресценции (гл. 15), тем, что не происходит перехода на более высокий электронный уровень. Причиной изменения частоты является либо возбужде­ние на более высокий колебательный уровень, либо добавление к электромагнитной энергии световой волны колебательной энер­гии молекулы.

Если в процессе рассеяния свет возбуждает рассеивающий центр на более высоком колебательном уровне, энергия теряется и частота уменьшается. С другой стороны, если рассеивающий центр находится на более высоком колебательном уровне (на­пример, за счет предварительных столкновений с молекулами растворителя), он может передавать свою колебательную энер­гию падающему свету и таким путем увеличивать его частоту. При обычно используемых температурах число молекул, обла­дающих запасом колебательной энергии, меньше, чем число молекул, не обладающих таковым, поэтому чаще частота умень­шается. Таким образом, спектроскопия комбинационного рас­сеяния, как и ИК-спектроскопия, изучает колебательные пере­ходы. Ранее, ввиду отсутствия источников света высокой интен­сивности и очень низкой интенсивности рассеянного света, метод КР-спектроскопии применялся относительно редко. К тому же изменения частот так малы, что требуется свет с высокой сте­пенью монохроматичности. Обе эти проблемы были недавно ре­шены путем использования в современных приборах лазеров. Это важный шаг вперед, так как КР-спектроскопия имеет то важ­ное преимущество перед ИК-спектроскопией, что можно рабо­тать в растворах НгО. На рис. 14-23 показан типичный КР- спектр.

КР-спектроскопия пока не имеет широкого распространения. Рассмотрим несколько возможных применений этого метода, описанных в литературе.

412 Глава 14

Доказательство цвиттер-ионного строения различных амино­кислот. Ионизация амино- и карбоксильной групп сопровожда­ется характерными изменениями в спектрах.

Распознавание аденозинмоно-, ди- и трифосфата и их иони­зованных форм в растворе. Метод используется для изучения не­которых ферментативных реакций, потому что по КР-спектру ре­акционной смеси можно определить относительные количества молекул каждого типа в процессе реакции или в равновесии.

Определение содержания в полиаминокислотах: а-спирали_г р-структуры и беспорядочного клубка. Как и в случае ИК-спек- троскопии, наблюдаются характерные амидные полосы, интен­сивность которых пропорциональна относительному содержанию структуры каждого типа.

Определение числа S—S-связей в белках. S—S- и S—Н-связи дают характерные у_макс-

Определение числа спаренных и неспаренных оснований в РНК. Каждое основание можно отличить по его КР-спектру, так что по относительной интенсивности пиков, соответствующих каждому основанию, можно определить состав оснований. Кро­ме того спектры меняются при дейтерировании, поэтому удается идентифицировать места медленного и быстрого обмена дейте­рия на водород. Считают, что основание, для которого наблюда­ется медленный обмен, находится в составе пары, поскольку во­дородные связи препятствуют обмену (см. пример 14-К).

Список литературы

Beaven G. Н., Johnson Е. A., Willis Н. A., Miller R. G. }., Molecular Spectrosco­py, Heywood, 1961.

Brewer I. М., Pesce A. }., Ashworth R. B., Experimental Techniques: in Biochemistry, Prentice-Hali, 1974, ch. 7.

Donovan J. W. Ultraviolet Difference Spectroscopy: New Techniques and Applications and Spectrophotometric Titration of the Functional Groups of Pro­teins, in “Methods in Enzymology”, vol. 27, edited by С. H. W. Hirs and S. N. Timasheff, Academic Press, 1973, pp. 497—525; 525—548.

Edisbury J. R., Practical Hints of Absorption Spectrometry, Helger-Watts, 1965.

Herskovitz J. Т., Difference Spectroscopy, in “Methods in Enzymology”, vol. 11, edited by С. H. Hirs, Academic Press, 1967, pp. 748—775.

Horton H. R., Koshland D. E., Environmental Sensitive Groups Attached to Proteins in “Methods in Enzymology”, vol. 11, edited by С. H. W. Hirs, Acade­mic Press, 1967, pp. 856—870. Описание использования репортерных групп.

Timasheff S. N., Some Physical Probes of Enzyme Structure in Solutions, in “The Enzymes”, vol. 2, edited by P. D. Boyer, Academic Press, 1970, pp. 371—443.

Задачи

14-1. Поглощение раствора, содержащего вещество с молекулярным ве­сом 423 в концентрации 32 мкг/мл, составляет 0,27 при 540 нм в односанти­метровой кювете. Чему равен коэффициент молярного погашения при 540 нм? Допустить, что закон Бера соблюдается.

14-2. Раствор соединения А имеет £)₂₆о=0,45 _и £450=0,03. Раствор вто­рого соединения Б имеет £>2бо=0,004 и D₄₅₀ = 0,81. 2 мл раствора А смешали с 1 мл раствора Б. Результирующая оптическая плотность смеси £)₂бо=0,3 и £*450=0,46. Имеется ли взаимодействие между А и Б? Объяснить. Какое до­пущение делается, чтобы подтвердить это заключение?

14-3. Допустим, что только что приготовлены два образца: один—■ на­тивной ДНК и другой — денатурированной ДНК — и каждый диализован против 0,01 М NaCl. Затем добавляют к каждому раствору очень маленькое количество фермента и снимают этикетки с образцов. Как путем измерения поглощения можно установить природу каждого образца? Можно принять, что в опыте расходуется небольшая часть каждого образца и что фермент не мешает опыту. Придумайте другой опыт, в котором не требуется введения денатурирующего агента или создания условий, вызывающих денатурацию.

14-4. Предположим, что вы захотели узнать, сколько цитохрома с содер­жится в одной клетке Е. coli. Известен молярный коэффициент погашения в максимуме поглощения. Как вы проделаете это измерение?

14-5. Молярный коэффициент погашения данного соединения 348 при 482 нм. Раствор этого соединения имеет Z>_4S2= 1,6. При разбавлении 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6 величины D_m составляют 1,52, 1,42, 1,05, 0,84, 0,70 и 0,61 соответственно. Какова молярность исходного раствора?

14. 6. Молярные коэффициенты погашения вещества А при 260 и 280 нм равны соответственно 5248 и 3150. Для выделения А используется реагент Б, имеющий молярные коэффициенты погашения 311 и 350 при 260 и 280 нм. После выделения A D_Z60=2,50 и D₂8o=2,00. Какова концентрация А?

14. 7. D₂бо денатурированной ДНК [измеренная при той температуре, ко­гда достигается максимальная Z)₂во (см. рис. 14-13)] постоянно на 37% выше, чем D нативной ДНК, например, при 20°С. Однако в 6 М растворе трифтор- ацетата натрия £>₂₆о образца ДНК только на 16% выше, чем при 20°С. Пред­ложите объяснение этого.

14. 8. Белок помещают в 20%-ный раствор этиленгликоля и снимают его дифференциальный спектр против раствора, не содержащего этиленгликоля. При всех длинах волн Де = 0. Что вы можете заключить о структуре белка?

Второй белок изучают в 20%-ном диметилсульфоксиде и 20%-ной саха­розе. В сахарозе Де = 0. В диметилсульфоксиде проявляется характерный диф­ференциальный спектр триптофана. Наблюдаемая величина Де удваивается, если белок нагревают в диметилсульфоксиде до 60°С. В 20%-ной сахарозе после нагревания до 60°С величина Де эквивалентна Де для 8 триптофановых остатков. Что вы можете сказать об этом белке?

14. 9. В процессе титрования белка при 295 нм найдено, что е₂₉₅ резко возрастает при pH 9,6. При pH 11,7 е₂₉₅ возрастает снова, причем это увели­чение составляет одну треть от первого. Если затем pH понизить до 6 и да­лее постепенно увеличивать, кривая зависимости є₂₉₅ от pH почти идентична кривой белка до титрования, за исключением того, что увеличение е₂₉₅ со­ставляет только две трети от наблюдаемого вначале. Известно, что в белке имеется восемь тирозиновых остатков. Что вы можете сказать о структуре белка?

14. 10. ДНК выделена из Е. coli. Среднее содержание G-С-пар в ДНК Е. coli 50%. ДНК растворили в смеси 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата Na. Получили кривую плавления. Вместо плавной кривой наблюдается двухсту­пенчатая, с Г_пл 80 и 88°С. Первая ступень составляет 20% всего возраста­ния. Какое объяснение можно дать этому явлению?

ДНК из другой бактерии выделена тем же способом, но случайно нагре­та до 75°С в течение 1 мин. Позднее ее использовали в эксперименте по плав­лению. Кривая плавления была неожиданной в том смысле, что, хотя глав­ный переход был между 82 и 88°С, имелось постепенное возрастание С₂бо на 10% в температурном интервале от 32 до 55°С. Объясните полученные данные.