Гендік инженерияны қолдану әдістері
Биолог зерттеушілері үшін бактериалды жасушаларының тұқым қуалау аппаратары үлкен қызығушылық тудырады. Бактерия жасушаларында ДНҚ-ы ядро орналасатын орта тұсында жайғасады. Бірақта, өсімдіктер мен жануарлар жасушаларындағы ядро құрамына кіретін ДНҚ-мен салыстырғанда, бактериялдық ДНҚ ядролық қабықпен қоршалмай, цитоплазмада бос күйінде жатады. Бактерия хромосомалары шеңберленіп біткен жіпшелерге ұқсас болады. Олар екі үзікті (цепь) ДНҚ молекулаларынан құралады.
Біздерге, ДНҚ молекуласының әрбір үзіктері бірнеше нуклеотидтерден тұратыны, яғни полинуклеотидті болып келетіні және өз кезегінде әрбір нуклеотидтер құрамына көміртегі дезоксирибозасы, фосфор қышқылдарының қалдықтары мен азот негізді заттар кіретіні белгілі. Нуклеотидтер бір-бірінен осы азот негізді заттар түрлерінің кіруіне байланысты ерекшеленеді. Бұл заттар қатарында аденин, гуанин, цитозин, тимин болуы мүмкін екендігін еске түсіре кетейік. ДНҚ үзіктерін құрайтын нуклеотидтер бір- бірімен фосфор қышқылы мен дезоксирибозалар арқылы белгілі бір ретпен байланысады. Мысалы, адениннің (А) бір үзігіне қарсы тиминннің (Т) екінші үзігі, ал гуанинге (Г) қарсы – цитозин (Ц) орналасады. Екі нуклеотидтер сутегілік байланыстар арқылы бірігіп тұрады және де мұнда олар бір-бірін толықтырып отырғандай болады. Сондықтан гуанинді – цитозинге, ал аденинді – тиминге комплементарлы (лат. Complemente – толықтыру деген мағынада) деп айтады.
ДНҚ молекуласындағы нуклеотидтердің белгілі бір ретпен орналасуы, олардағы қандай да бір ақуыздың синтезделуі жөніндегі информациясын сақтайды. Егерде, белгілі бір себептермен нуклеотидтердің біреуі кірмей немесе алмасып қалса, басқа ақуыз синтезі жүре бастайды. Сондықтан ақуыз құрылымы жөнінде мәлімет сақталған ДНҚ бөлігі – геном деп аталады.
Кейбір бактериялардың хромосомдар құрылымы толықтай белгілі болған. Мысалы сенна таяқшасы деген атпен белгілі бактерияларының хромосомасы 200-ден аса геннен тұрады. Ғалымдар осы гендердің хромосома шеңберінде орналасуының картасын жасаған.
Гибридті ДНҚ алу барысында атқарылатын ген инженериясы жұмыстарының дұрыс жүруіне, бактериалды жасуша бірліктеріне кіретін плазмидтер деп аталатын құрылымдар үлкен роль атқаратындығы анықталған. Плазмида терминін қолданысқа америкалық ғалым генетик және биохимик Джошуа Ледерберг 1952 ж. енгізді.
Плазмидтер дегеніміз – құрамына 2250-ден 400000 жұпқа дейін нуклеотидтер кіретін ДНҚ молекуласы болып табылады. Олар бактериялар жасушаларында бірден бастап бірнеше ондық жұп көлемінде кездесуі мүмкін және хромосомалардан бөлек орналасады. Бактерия хромосомасы сияқты плазмидтер де шеңбер тәрізді болып біткенімен, хромосомалардан әжептеуір кіші болады. Плазмидтердегі ДНҚ саны бактериялды хромосомалармен салыстырғанда 20-1000 есеге дейін аз болады. Плазмидтер бактериялды хромосомаларға тәуелсіз екі еселене алу (репликациялану) ерекшеліктеріне ие. Плазмидтер бактериялды жасушаларының дәрілерге, мысалы антибиотиктерге қарсы тұру қабілеттіліктеріне жауап береді. Бұлардың ең маңызды қасиеттері қатарына бір жасушадан екінші жасушаға өте алу ерекшелігін жатқызуға болады.
Егерде плазмидаға ДНҚ-ның қандай да бір бөлігін ендірсе, ол плазмидамен бірге репликацияланады. Осы ерекшеліктің арқасында адамдарды қызықтыратын қажетті гендерді еселей көбейтіп (клондап) алуға болады.
Генетикалық инженерияның әдістерін дамытуда эндонуклеазалар деп аталатын спецификалық ферменттер өте үлкен маңызға ие болды. Ферменттер – ағзадағы жүретін биохимиялық үдерістердің қарқынын бірнеше есе арттыра алатын, шығу тегі ақуыздық негізді болып келетін биологиялық катализаторлар екенін еске түсіре кетейік. Эндонуклеазалар бактериялды жасушаларының өздерімен синтезделеді және шеңберлі ДНҚ молекулаларын сызықты бөліктерге кесе алатын қабілетке ие екендіктері анықталған. Осындай ферменттердің барлығы жөніндегі ойлар, өткен ғасырдың 50-ші жылдарының басында бірнеше зертханаларда жүргізілген тәжірибелер барысында, бактериалды жасушаларында бактериофагтардың (бактерия вирустары) көп көбейе алмауы себебі анықталғаннан кейін жасалынған болатын. Рестрикция деген сөз бір нәрсенің шектелуін білдіреді. Сол себептен бактериофагтардың көбейуіне шектеу келтіретін фермент түрлері – рестриктазалар деп атала басталды. Қазіргі кезде оларды әртүрлі микроорганизмдерден бөліп алады. Олар генетикалық инженерияда жасалатын тәжірибелерде міндетті түрде қолданыла бастады. Рестриктазалар көмегімен ДНҚ молекулаларын қажетті жерлерінен кесіп алу мүмкін болды.
Бактериялды жасушаларда рестриктаза ферменттерімен бірге, рестриктазалар кескен ДНҚ бөліктерін қайта «тіге» немесе «желімдей» алатын лигаза атты ферменттер де синтезделетіні белгілі болды. Сондықтан, рестриктаза мен лигаза ферменттерінің ашылуы генетикалық инженерияның дамуына үлкен жол ашты. Бұл ферменттердің көмегімен, қажетті қасиеттерге ие ДНҚ молекулаларын арнайы құрастыру мүмкіндігіне жол ашылды.
Ген инженериясының негізгі мазмұны – ағзадағы қажетті генді бөліп алып, оны вектормен біріктіруге саяды. Мұнда көбінесе генетикалық вектор ретінде плазмидалық ДНҚ-ын пайдаланады. Осы үдеріс нәтижесінде алынған гибридті ДНҚ молекуласы (рекомбинантты, яғни рДНҚ), бактерия жасушасына ендіріледі. Бактерия жасушасында векторлардың еселенуі (репликация) нәтижесінде, дайындалған гибридті рДНҚ молекулаларының да саны арта бастайды. Бұл үдеріс – рекомбинантты ДНҚ-ын клондау деп аталады.
Жалпылай алғанда гендік инженерия жұмыстарының барысы өз кезегімен атқарылатын келесідей кезеңдерден тұрады деуге болады:
1. Ағза жасушаларынан (Е. coli) қажетті ДНҚ-ын және ДНҚ векторларын бөліп алу.
ДНҚ-ын арнаулы рестриктаза ферменттері арқылы қажетті гені бар бөліктерінен бөлу және бөлінген генді пайда болған рестриктазалық қосындылар арасынан ажыратып алу.
Ағзалардан алынған қажетті ДНҚ-ның бөліктерін (гендерді) лигаза ферменттерін қолдана отырып ДНҚ векторларымен біріктіру (рДНҚ құрау).
Құрастырылған рДНҚ-ын арнайы дайындалған ағзаларға, мысалы Е. coli немесе денелік жасушаларына ендіру.
ДНҚ молекулалары егілген гибридті бактерияларды арнайы қоректік ортаға себу арқылы, тек олардың көбеюін (репликациясын) қамтамасыз ету (Гендердің генотиптік көрініс беруі экспрессия деп аталады).
ДНҚ молекулалары егілген гибридті бактериялар колонияларын идентификациялау.
Клондалған ДНҚ (клондалған гендерді) бөлу және оларды сипаттау. Бұл кезеңде клондалған ДНҚ бөліктеріндегі азотты негіздері де кесіп (секвенирование) тасталады.
Жоғарыда айтылған гендік инженерия жұмыстарының кезеңдерін жалпылай сызбанұсқа түрінде көрсететін болсақ, келесі келтірілген суреттегідей болады (сурет-3)
Клондалған ДНҚ бөлу
және сипаттау
3-сурет. Гендік инженерия жұмыстарының атқарылу кезеңдері
Қажетті ДНҚ-ын бөліп алу жұмыстары техникалық жағынан қандай да бір қиыншылықтар тудырмайды. Бұл әдіс ғылымда 40 жылдай қолданылып келеді. Осындай экстракциялау жұмыстары нәтижесінде жасушалар мен ұлпалардан құрамында ақуыз немесе басқа да заттары жоқ ДНҚ-ның таза түрі алынады. Қажетті ДНҚ-ын бөліп алу жұмыстарының атқарылу кезеңдерін төменде келтірілген сызбанұсқа түрінде көрсетуге болады (сурет-4).
4-сурет. Қажетті ДНҚ-ын бөліп алу жұмыстарының атқарылуы
ДНҚ-ын рестриктаза ферменттері арқылы бөліктерге бөлу жұмыстарын бірнеше әдістер арқылы жүзеге асыруға болады. Бірақта олардың барлығын гендік инженерия мақсатында қолдана алмаймыз. Ол үшін үлескілерге бөлінген ДНҚ-ның қайтадан бір-бірімен біріге алатындай күйде болуын қамтамасыз ету қажет болады.
Өткен ғасырдың 70 жылдарының орта шенінде рестриктаза ферменттерінің көмегімен ДНҚ-ын кесілген ұштарына ДНҚ-ның екінші бір бөліктерін жапсыра алатындай етіп бөлу мүмкіндігі ашылғаннан кейін, генетикалық инженерияның дамуына кең жол ашылып, рекомбинантты ДНҚ алу технологиясының қалыптасуына бастау болды. Мысалы E. coli ферменті алты жұп нуклеотидтен тұратын ДНҚ үлескілерін белгілеп, осы бөліктегі ДНҚ-ның екі жіпшелі құрылымын олардың кесілген екі ұштарының әрқайсысында төрт нуклеотидтерден құралған бір жіпшелі үзіктерден тұратындай етіп кесе алады екен. Кесілген мұндай ұштар комплиментарлы және бір-бірімен сутегілік байланыс арқылы өзара әрекеттесе алатын болғандықтан «жабысқақ» деп аталады. Осы мақсатта қолданылатын ферменттер, ДНҚ үлескілерін олардың құрамындағы нуклеин қышқылдарының шығу тегіне байланыссыз танып-белгілей беретін болғандықтан, ДНҚ бөлінген үлескілері ұштарының барлығы бірдей «жабысқақ» күйде болады. Сонымен бірге, өздерінің әрекеттері нәтижесінде ДНҚ кесілген үлескілеріндегі екі үзік ұштары да жапсырылған, яғни «доғал» күйінде болып шығуы себепті, бір-бірімен жабыса алмайтындай дәрежеде дайындайтын рестриктаза ферменттерінің де бар екендігі белгілі болды.
Рестриктаза ферменттерінің ДНҚ-ын кесу нәтижесінде олардың көптеген бөліктері алынады. Бөліктердің саны бұл мақсатта қолданылатын рестриктаза ферменттерінің түріне байланысты болады. Гендер «кітапханасын» жасау үшін, ДНҚ-ын бірнеше ондаған немесе жүздеген мың бөліктерге бөлу қажет болады.