3. Комбинированные препараты (рис. 3).

В целях экономии стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят "тонкий мазок" и "толстую каплю".

Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходима четкая последовательность их обработки. Необходимо начинать с окраски "толстой капли" погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют "тонкий мазок" и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации "тонкого мазка", т.к. даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен "тонкий мазок", в "толстой капле" эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.

Все препараты высушивают на воздухе. Для ускорения высыхания "толстых капель" можно использовать обычный комнатный вентилятор.

┌────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Высушивание на солнце, огне или любом другом источнике тепла│

│исключается, так как препарат становится непригодным для│

│исследования. │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Особенно это относится к "толстой капле", которая под действием тепла подвергается аутофиксации и необходимый гемолиз при окраске не наступает. "Толстые капли" (особенно в процессе высыхания) и фиксированные "тонкие мазки" следует беречь от тараканов, мух и муравьев, съедающих кровь.

6.4.2. Препарат "тонкий мазок" (рис. 4)

1. На край предметного стекла, отступив 0,5 - 1 см, наносят небольшую каплю крови (объемом меньше в 5 - 10 раз, чем для препарата "толстая капля").

2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа <*>.

3. Двумя пальцами левой <*> руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой <*> руке) ставится под углом 45° к предметному стеклу, прикасаясь к левому <*> краю капли крови.

5. После того как капля растекается по касательной линии в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево <*> к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить "тонкий мазок" бахромчатой частью, где наиболее четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить до конца и краев предметного стекла, заканчиваться бахромчатым краем (рис. 4).

--------------------------------

<*> Для лаборанта - левши читать вместо левого положения - правое, вместо правого - левое.

Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это маскирует некоторых паразитов, а также приводит к их деформации); если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка. Качество "тонкого мазка" зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.

На плохо вымытом жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла "тонкий мазок" получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис. 5.

6.4.3. Маркировка препаратов крови

1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания).

2. Маркировка включает фамилию и инициалы, или номер истории болезни (можно номер страхового полиса), или порядковый номер по списку обследуемого и, обязательно, дату взятия крови.

3. Препарат "толстая капля", приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4. Препарат "толстая капля" на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.

5. "Тонкий мазок" маркируют в толстой части (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

6.4.4. Фиксация "тонких мазков"

1. Фиксацию мазков проводят в этиловом спирте 96% - 10 мин. или в смеси Никифорова - 20 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.

Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

┌──────────────────────────────────────┐

│Препарат "толстая капля" не фиксируют!│

└──────────────────────────────────────┘

При длительном хранении (особенно в жарком климате) неокрашенных "толстых капель" может произойти их аутофиксация. При необходимости хранения "толстых капель" для предотвращения аутофиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г Na2HPO4 + 1 г KH2PO4 + 300 мл дистиллированной воды). "Толстую каплю" после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием окрашивают по Романовскому меньше, чем обычное время - в течение 6 - 10 минут.

6.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови.

6.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского - Гимза

Для окрашивания препаратов крови используется 5% или 10% водный рабочий раствор краски Романовского - Гимза.

1. Маточный раствор краски Романовского - Гимза (промышленного изготовления или приготовленный из сухой краски) перемешать и обязательно профильтровать.

2. Приготовить 5-процентный (10-процентный) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски, что соответствует 1 - 2 каплям краски на 1 мл раствора.

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20-процентный раствор, сократив время окраски до 15 - 20 мин.

┌────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Рабочий раствор для окраски препаратов крови использовать│

│только свежеприготовленный! │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Качество каждой новой серии краски необходимо оценить. С этой целью производят пробную окраску препаратов "тонкого мазка" и "толстой капли" крови от здорового человека (если нет крови с малярийными паразитами). Концентрацию рабочего раствора и время окрашивания можно подобрать самостоятельно, т.к. они зависят от качества исходного раствора краски и от температуры окружающей среды.

Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроскопии:

- ядра лейкоцитов фиолетово - красного цвета с различимой структурой;

- зернистость базофилов фиолетового цвета;

- зернистость эозинофилов красного цвета;

- у моноцитов на фоне серо - голубой цитоплазмы может быть розовая зернистость;

- зрелые эритроциты - розового цвета с сероватым оттенком;

- ретикулоциты - сиренево - голубые;

- тромбоциты - сиренево - розового цвета с различимой сетчатостью.

Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского недостаточно азура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов и лейкоцитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мансона, которую готовят впрок следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2,5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10 - 12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40 - 60 мин. при 60 - 80°.

┌────────────────────┐

│Раствор не кипятить!│

└────────────────────┘

Синька Мансона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мансона, добавляемое к рабочему раствору краски Романовского, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

6.5.2. Способы окрашивания и промывки "тонкого мазка" и "толстой капли" по Романовскому - Гимза

Окрашивание препаратов крови можно проводить двумя способами.

1. Препараты крови вертикально помещают в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Затем наливают рабочий раствор краски. Данный способ наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов крови. В стандартном контейнере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторно использовать краску не следует.

2. Препараты располагают горизонтально (мазками вверх) на стеклянных рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно пипеткой, так чтобы краска полностью покрывала мазок или толстую каплю, наносят краску. Этот способ чаще применяют при окрашивании небольшого количества препаратов крови. Расход краски составляет примерно 4 мл на 1 препарат.

Данный способ окраски требует тщательной фильтрации маточного раствора краски, т.к. есть вероятность выпадения осадка на препарат крови, что приведет к трудности в диагностике кровепаразитов при микроскопии.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды. При температуре 20 - 23° "тонкий мазок" окрашивают 40 - 50 мин., "толстую каплю" - 20 - 25 мин. При более низкой температуре время окрашивания увеличивают. При очень высокой температуре (около 30°) время окрашивания капель, но не мазков, может быть сокращено до 15 мин. "Толстые капли", предварительно обработанные забуференным раствором метиленового синего, окрашивают 6 - 10 мин.

┌────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ При подозрении на малярию препараты крови помечаются "CITO!".│

│Окрашиваются и исследуются немедленно. │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Ошибки при окраске препаратов крови и способы их устранения приведены в табл. 1 Прилож. 1.X

Способ промывки "тонких мазков", фиксированных до окраски, - под струей проточной воды, из пипетки или погружением в емкость - не имеет значения, важно только не обесцветить препарат.

При промывке "толстых капель", особенно свежеприготовленных, необходима осторожность, т.к. капли могут оторваться от стекла. Препарат медленным движением погружают в емкость с дистиллированной водой 1 - 2 раза.