6. Проведение анализа

Микроколонки достают из холодильника, снимают сначала верхнюю крышку, затем нижний колпачок и сливают консервирующий раствор. Микроколонки помещают в штатив и выдерживают при комнатной температуре 15–20 мин.

В это время на водяной бане рабочий буферный раствор I доводят до температуры около 25 С, постоянно перемешивая. Для каждого анализируемого образца крови маркируют две пробирки А и Б. В пробирку А помещают микроколонку, пипеткой вносят в нее 5,0 мл рабочего буферного раствора I и дают жидкости стечь. После полного стекания раствора на верхний фильтр микроколонки вносят 0,1 мл исследуемого гемолизата, выдерживают 1–2 мин, затем вносят 0,1 мл рабочего буферного раствора I и выдерживают 5–10 мин. Затем в микроколонки вносят 5,0 мл рабочего буферного раствора I и дают жидкости стечь.

Микроколонку переносят в пробирку Б, вносят 4,0 мл рабочего буферного раствора II и дают ему стечь. Микроколонку вынимают и помещают в пустую пробирку, затем вносят в нее 10 мл регенерирующего раствора.

В это время содержимое пробирки А перемешивают и помещают в кювету фотоэлектроколориметра. Измеряют оптическую плотность раствора (А_А) при длине волны 414 нм, используя в качестве образца сравнения дистиллированную воду. Аналогично поступают с содержимым пробирки Б.

Содержание гликозилированного гемоглобина в процентах рассчитывают по формуле:

%GHb = А_Б*100:(А_Б + 2,55*А_А),

где А_А и А_Б – значения оптической плотности растворов А и Б при 414 нм; 2,55 – пересчетный коэффициент оптической плотности фракции А; 100 – пересчетный коэффициент для вычисления процентного содержания.

Для пересчета процентного содержания гликозилированного гемоглобина, соответствующего другим методам его определения, используют следующие формулы:

• для метода ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии):

%GHb’ = 0,75*%GHb + 2,7;

• для метода иммунофлуоресцентного анализа (на анализаторе «Abbott IMx»):

%GHb’’ = (%GHb’+ 1,76) : 1,49.

Пример расчета:

А_А = 0,68

А_Б = 0,10

%GHb = 0,10*100:(0,10 + 2,55*0,68) = 5,5 %

%GHb’ = (0,75*5,5) + 2,7 = 6,8 %

%GHb’’= (6,8 + 1,76) : 1,49 = 5,7 %

Надежность метода проверяется по контрольному образцу гликозилированного гемоглобина. Результаты анализа сравниваются с нормой содержания гликозилированного гемоглобина в крови здоровых людей: 4,4 – 8,0 %.

7. Консервация микроколонок

После полного истечения из микроколонок регенерирующего раствора в них наливают 10 мл дистиллированной воды и дают жидкости стечь. Затем в микроколонки вносят 5 мл консервирующего раствора, после протекания 1-2 мл устанавливают сначала верхнюю крышку, затем нижний колпачок. Микроколонки хранят в холодильнике при 4‑8 С.

Задания для домашней работы

1. Напишите циклическую формулу - и - рибофуранозы.

2. Напишите формулу дезоксирибозы в её открытой и циклической формах.

3. Являются ли манноза и галактоза эпимерными изомерами?

4. Напишите формулу альдогексозы, эпимерную галактозе.

5. Напишите циклическую формулу - и - глюкозы.

6. Напишите циклическую формулу - и - фруктозы.

7. Напишите циклическую формулу - и -галактопиранозы.

8. Проекционная формула D-арабинозы

Напишите проекционную формулу L-арабинозы.

9. Проекционная формула D-рибозы

Напишите проекционную формулу L-рибозы.

10. Проекционная формула D-ксилозы

Напишите проекционную формулу L-ксилозы.

11. Важную роль в обмене углеводов играют фосфорные эфиры глюкозы. Напишите в циклической форме формулу глюкозо-1-фосфата.

12. Важную роль в обмене углеводов играют фосфорные эфиры глюкозы. Напишите формулу циклического глюкозо-6-фосфата.

13. Сахароза при участии фосфорилазы подвергается фосфоролизу:

сахароза + H₃PO₄ = -D-глюкозо-1-фосфат + -D-фруктофураноза

Напишите полное уравнение реакции в соответствии с приведённой схемой.

14. Фермент мальтозофосфорилаза, содержащийся в бактериях, действует на мальтозу по схеме:

мальтоза + ортофосфат =  - D – глюкозо – 1 - фосфат + D – глюкоза

Напишите уравнение этой реакции.

15. Под влиянием фермента галактокиназы D–галактоза образует фосфорный эфир за счёт переноса фосфатной группы с АТФ:

D-галактоза + АТФ = D-галактозо-1-фосфат + АДФ

Напишите уравнение этой реакции.

16. Фосфофруктокиназа катализирует перенос фосфатной группы:

D-фруктозо-6-фосфат + АТФ = D-фруктозо-1,6-дифосфат + АДФ

Напишите уравнение этой реакции.

17. Фермент фосфофруктокиназа катализирует превращение:

D-фруктозо-1-фосфат + АТФ = D-фруктозо-1,6-дифосфат + АДФ

Напишите уравнение реакции.

18. При каталитическом действии глюкозо-1-фосфатфосфодисмутазы происходит реакция, выражаемая следующей схемой:

D-глюкозо-1-фосфат + D-глюкозо-1-фосфат = D-глюкозо-1,6-дифосфат + D-глюкоза.

Напишите уравнение этой реакции.

19. Фермент глюкозо-6-фосфатаза катализирует реакцию:

D-глюкозо-6-фосфат + H₂O = D-глюкоза + ортофосфорная кислота

Напишите уравнение этой реакции.

20. Глюкозо-1-фосфатаза катализирует реакцию:

D-глюкозо-1-фосфат + H₂O = D-глюкоза + ортофосфорная кислота

Напишите уравнение этой реакции.

21. Под влиянием фермента гексозодифосфатазы происходит реакция:

D-фруктозо-1,6-дифосфат + H₂O = D-фруктозо-6-фосфат + ортофосфорная кислота

Напишите уравнение этой реакции.

22. Напишите схему полного окисления (до дикарбоновой кислоты) D-глюкозы.

23. Альдозы легко восстанавливаются по альдегидной группе с образованием полиспиртов. Напишите схему реакции восстановления:

a) D-глюкозы (получается D-сорбит);

b) D-маннозы (получается D-маннит);

c) D-рибозы (получается D-рибит);

d) D-ксилозы (получается D- ксилит).

24. Напишите схему гидролиза:

a) мальтозы;

b) лактозы;

c) целлобиозы;

d) сахарозы.

Назовите продукты реакции.

25. Напишите схему полного гидролиза крахмала. Назовите конечный продукт реакции.

26. Напишите схему полного гидролиза целлюлозы (клетчатки). Назовите конечный продукт реакции.

27. Сахароза синтезируется в организме. Данный процесс катализируется ферментом сахарозоглюкозилтрансферазой. Напишите уравнение этой реакции в соответствии со схемой:

-D-глюкозо-1-фосфат + -D-фруктоза = сахароза + H₃PO₄

28. Мальтоза синтезируется в организме бактерий. Напишите уравнение реакции в соответствии со схемой:

-D-глюкозо-1-фосфат + D- глюкоза = мальтоза + H₃PO₄

29. С пищей в организм человека поступает не только глюкоза, но и фруктоза, и галактоза. Эти сахара взаимно превращаются друг в друга.

Так, фруктоза преобразуется в глюкозу по следующей схеме:

1. - D- фруктоза + АТФ = фруктозо-6-фосфат + АДФ;

2. фруктозо-6-фосфат + НАД^. Н₂ = сорбит-6-фосфат + НАД;

3. сорбит-6-фосфат + НАДФ = НАДФ^.Н₂ + глюкозо-6-фосфат.

Напишите уравнения этих превращений.

30. Напишите уравнения реакций фосфоролиза крахмала.

Таблица 15