5.2. Дезоксирибонуклеиновая кислота (днк)

5.2.1. Первичная структура днк

Первичная структура ДНК представлена двухцепочечными полидезоксирибонуклеотидами с уникальным сочетанием дезоксирибонуклеотидных остатков (дАМФ, дТМФ, дГМФ, дЦМФ).

Например, ген человеческого лейкоцитарного интерферона состоит из 520 дезоксирибонуклеотидных остатков:

ТГТ ТЦТ ЦТГ ГГЦ ТГТ…

Структура ДНК лучше изучена у прокариот (например, E.coli), т.к. ее легче извлечь, сняв мембранную оболочку, в нативной форме. Однако, в середине 70-х годов прошлого столетия были разработаны методы изучения первичной структуры ДНК (ДНК-секвенирование, от англ. sequence – последовательность):

1. энзиматический (или метод полимерного копирования): в 1975 г. Ф. Сангер (он же в 1953 г. открыл первичную структуру инсулина) и Р. Коулсон предложили получать набор копий ДНК (убывающих по числу нуклеотидных остатков) при помощи ДНК-полимеразной реакции. При помощи фермента (ДНК-полимеразы) синтезировались копии ДНК, заканчивающиеся на одном из нуклеотидов. В 1976 г. таким образом была определена структура гена фага Х 174 (5 375 п.н.).

ддНТФ – «брачный» нуклеозидтрифосфат (2’,3’-дидезоксирибонук-леозидтрифосфат): в связи с тем, что в положении 3’ монозы отсутствует ОН-группа, такой нуклеотид не способен к образованию 3’-5’ фосфодиэфирной связи, поэтому происходит обрыв синтезируемой цепи ДНК. Например, структура ддГТФ:

Таким образом, получают набор фрагментов с одинаковыми концом (например, Г), затем при помощи электрофореза в ПААГ (полиакриламидном геле) анализируют образующиеся фрагменты и проводят статистический анализ результатов с целью определения нуклеотидной последовательности ДНК-матрицы;

2. химический метод (1977 г.): А. Максам и В. Гильберт предложили избирательно расщеплять цепь ДНК по месту модифицированных пуриновых и пиримидиновых оснований (одного или двух): 5’ или 3’-конец ДНК метится радиоактивным изотопом ³²Р, затем цепь ДНК обрабатывают специальным химическим веществом (например, диметилсульфатом (СН₃)₂SO₄), вызывающим структурные изменения в одном из азотистых оснований, что приводит к обрыву цепи по месту модификации азотистого основания (например, Г).

Анализ полученных фрагментов ДНК проводят, как и в методе (1).

5.2.2. Вторичная структура днк

Вторичная структура ДНК была открыта в 1953 г. Д. Уотсоном и Ф. Криком: двойная спираль, состоящая из двух антипараллельных полинуклеотидных цепей. Азотистые основания, принадлежащие двум цепочкам, избирательно присоединяются водородными связями:

П

уриновые и пиримидиновые основания в двойной спирали расположены «стопкой», в которой плоскости циклических молекул нуклеотидов параллельны друг другу и перпендикулярны оси спирали.

В

итоге: как в случае АТ, так и в случае ГЦ получается «мостик», состоящий из 3-х гетероциклов (~ одинаковой геометрической конфигурации).

Таким образом, цепи ДНК являются антипараллельными: для лейкоцентарного человеческого интерферона:

1 цепь: АТЦ ТГТ ТЦТ ЦТГ ГГЦ ТГТ ~ в цепь

2 цепь: ТАГ АЦА АГА ГАЦ ЦЦГ АЦА ~ в цепь

Особенности вторичной структуры ДНК отражают правила Э. Чаргаффа (1950):

1. Сумма пуриновых нуклеотидов равна сумме пиримидиновых нуклеотидов: ПУР = ПИР.

2. Молярное содержание аденина равно молярному содержанию тимина: А = Т.

3. Молярное содержание гуанина равно молярному содержанию цитозина: Г = Ц.

4. Количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина: А+Ц = Г+Т.

5. В ДНК из различных источников соотношение нуклеотидов неодинаково, возможно: А+Т  Ц+Г (АТ-тип ДНК)

Г+Ц  А+Т (ГЦ-тип ДНК)

- коэффициент видоспецифичности. На основании правил Э. Чаргафф выдвинул положение о видовой специфичности ДНК по нуклеотидному составу.