Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
С.35-54.doc
Скачиваний:
0
Добавлен:
01.07.2025
Размер:
284.16 Кб
Скачать
  • гель-проникающая (молекулярно-ситовая) хроматография (позволяет разделять белки в соответствии с размерами их молекул. В качестве неподвижной фазы используют пористые материалы (синтетические смолы, пористое стекло – биоглас, пористый кварц – порасил, производные полисахаридов на основе декстрана – сефадекс, агарозы – сефароза, синтетического полимера полиакриламида – биогель Р и др.).

В зависимости от размеров (и молекулярной массы) время прохождения белковых молекул через колонку будет разным, следовательно, можно разделить фракции: первыми из колонки выходят более крупные белки, затем – более мелкие (т. к. они проникают в поры сефадекса и удерживаются в них).

  • аффинная (от англ. affinity – сродство) хроматография (биоспецифическая адсорбционная хроматография). Основана на специфическом взаимодействии выделяемого вещества (белка, фермента) со специфическими веществами (лигандами: антиген, кофактор, рецептор и др.), закрепленными на матрице.

И

ммобилизации лиганда на поверхности носителя, как правило, предшествует стадии активации носителя: обработка бромцианом (BrCN) в щелочной среде (рН=11).

4) очистка белков.

Выделенные описанными выше способами белки, как правило, содержат низкомолекулярные примеси. Для очистки применяют следующие методы:

  • диализ;

  • электродиализ (возле полупроницаемых мембран диализной камеры помещают электроды, на которые подают напряжение);

  • гель-фильтрация (на сефадексе);

  • ультрафильтрация (сжатым газом через калиброванную полупроницаемую мембрану продавливается белковый раствор – белок остается на мембране, низкомолекулярные соединения проходят сквозь поры);

  • кристаллизация и перекристаллизация (с помощью этих процедур достигается высокая степень чистоты). В 1906 г. русский химик А. Д. Розенфельд впервые закристаллизовал оксидазу, в 1926 г. американский ученый Д. Самнер – уреазу.

3.5. Молекулярная масса белков и методы ее определения Молекулярная масса белка

физическое значение молекулярной массы (определяется физическими методами с точностью 100-1000 а.е.м.)

химическое значение молекулярной массы (для белков с расшифрованной первичной структурой, точность: 10-2 а.е.м.)

Методы определения молекулярной массы

  • гравиметрический (идея этого метода была высказана русским химиком Думанским А. В. в 1913 г.; шведский химик Сведберг Т. в 1923 г. сконструировал прибор: ультрацентрифугу с оптической приставкой).

Молекулярная масса определяется по скорости оседания белковых частиц. Исследуемый раствор белка помещают в кварцевую ячейку и включают центрифугу. Фотоприставка фиксирует содержимое ячейки через определенные промежутки времени.

,

где М – молярная масса; R – универсальная газовая постоянная; D – коэффициент диффузии; S – постоянная седиментации (определяется экспериментально);  - плотность растворителя;  - плотность белковых частиц;

  • гель-фильтрационный

,

где l – длина пробега белка в тонком слое сефадекса;

  • электрофоретический:

,

где l – длина пробега белка при электрофорезе в полиакриламидном геле;

  • п о осмотическому давлению;

  • по вязкости;

  • по данным рентгеноструктурного анализа; используются

  • по данным электронной микроскопии; редко

  • по светорассеянию.

3.6. Оптические свойства белков

Как правило, все белки поглощают УФ свет в трех областях: наиболее интенсивно при  = 280 нм, при  = 210-250 нм и при  = 190 нм. На этом свойстве основан спектрофотометрический метод количественного определения белков: метод не очень точный, но простой, поэтому широко применяется. При толщине кюветы 1 см и = 280 нм 1 единица оптической плотности соответствует 1 мг белка на 1 мл раствора.

В видимой области спектра поглощают окрашенные белки, например, гемоглобины, цитохромы, флавопротеины, «голубой белок» из Pseudomonas и др.

В ИК области поглощают все белки, это используется при определении ориентации водородных связей.

Белки – оптически активны (т. к. содержат хиральные атомы углерода), следовательно, они вращают плоскость проходящего через них плоскополяризованного света.

Для белков характерно явление оптической анизотропии – различие оптических свойств по разным направлениям (обусловлена внутренним строением, конформацией).

Белковые растворы способны флуоресцировать (испускать квант света h при переходе из возбужденного в основное электронное состояние). Флуоресцируют, как правило, белки, содержащие остатки ароматических аминокислот: три, тир, фен.

3.7. Амфотерные свойства белков

Белки – амфотерные электролиты, т. к. в их состав входят амфотерные аминокислоты. В нейтральной среде аминокислоты существуют в виде биполярных ионов:

В растворах аминокислоты могут вести себя как основания (акцепторы протонов):

либо как кислоты (доноры протонов):

Влияние положительно заряженной аммонийной группы в ‑положении делает -карбоксильную группу значительно более сильной по сравнению с карбоксилом алифатических кислот. Так, если рКа уксусной кислоты составляет 4,7, то у глицина рКа карбоксила равен 2,34. Близкие значения имеют рКа карбоксильных групп и других -аминокислот (см. табл.). -Аминогруппа в -аминокислотах испытывает влияние карбоксилат-иона и становится значительно менее основной, чем аминогруппа первичных алифатических аминов – ее рКа равен 9,6 – 9,7 в отличие от 10,7 для этиламина.

Аминокислоты

рК1

рК2

рНI

Глицин

D, L-аланин

D, L-фенилаланин

D, L-серин

rac-серин

D, L-валин

L-валин

D, L-лейцин

D, L-изолейцин

L-пролин

2,35

2,35

2,58

2,21

2,19

2,29

2,48

2,33

2,32

2,00

9,78

9,87

9,24

9,15

9,21

9,72

9,71

9,74

9,76

10,60

6,06

6,11

5,91

5,68

5,70

6,00

6,10

6,04

6,04

6,30

На рис. изображен вид кривой титрования 0,1 М раствора аланина 0,1 М раствором NaOH.

Кислотно-основные свойства белков определяются, в основном, R-группами аминокислотных остатков, вклад N- и с-концов незначителен. Заряд белковых молекул зависит от рН среды.

Изоэлектрическая точка (ИЭТ) – значение рН, при котором белок не несет суммарного заряда и не движется в электрическом поле.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]