Количественное определение белка в коротковолновом ультрафиолете

    В ультрафиолетовой области спектра все белки, кроме протаминов, имеют определенную полосу поглощения – в пределах длин волн 275-280 нм. Определив на спектрофотометре интенсивность поглощения света раствором белка, можно установить и его концентрацию. При использовании кюветы с шириной слоя 10 мм оптическая плотность раствора, в 1 мл которого содержится 1 мг «усредненного» белка, составляет 1,0 (при длине волны 280 нм). Соответственно, при содержании белка 0,5 мг/мл оптическая плотность в растворе составляет 0,5 и т.д. Исходя из этого и производится расчет.

     Припцип метода. Метод базируется на регистрации поглощения белком ультрафиолетового светового потока с последующим установлением на основании этого концентрации общего белка сыворотки (плазмы) крови.

Ход определения

(1-й вариант исследования)

      Сыворотку крови разводят изотоническим раствором в 250 раз (для этого 0,1 мл сыворотки крови доводят до 25 мл). Полученный раствор вносят в стандартную прямоугольную кварцевую кювету. Оптическую плотность измеряют при длине волны 280 нм (желательно выполнять параллельные исследования). Найденную величину умножают на число, показывающее разведение сыворотки. Таким образом рассчитывают концентрацию белка в г/л.

      Пример расчета: средняя величина абсорбции для двух параллельно обрабатываемых проб составляет 0,320. Чтобы найти концентрацию белка в г/л, показатель абсорбции 0,320 умножают на 250, получая тем самым значение концентрации белка в размерности «г/л» (в приведенном случае – 80 г/л).

      В общем виде формула расчета содержания «полного» белка в биологической жидкости имеет вид:

С (г/л) = А • F,

      где С - концентрация белка (г/л), А - показатель абсорбции, F - степень разведения.

Как было отмечено, некоторые авторы для установления содержания белка в сыворотке крови рекомендуют дополнительно замерять абсорбцию при другой длине волны.

Ход определения

(2-й вариант исследования)

      Сыворотку крови перед определением содержания общего белка разводят дистиллированной водой в 50 или 100 раз. Затем в кювете с шириной слоя 10 мм замеряют абсорбцию одной и той же пробы при двух длинах волн: 280 и 260 нм.

      Расчет производят по формуле: С (г/л) = (1,45 • А₂₈₀ – 0,74 • А₂₆₀) х 100.

     Пример расчета. При 100-кратном разбавлении сыворотки крови дистиллированной водой показатели оптической плотности анализируемого раствора при длине волн монохроматического ультрафиолетового света 280 и 260 нм составили соответственно 0,62 и 0,42. Применив приведенную формулу расчета, находим:

       С = 1,45 • 0,62 - 0,74 • 0,42 = 0,588 (разведенная сыворотка). 0,588 х 100 = 58,80 г/л.

Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра

Колориметрическим методом определяют концентрацию веществ в окрашенных прозрачных растворах по интенсивности окраски раствора. В основу колориметрического метода анализа положен закон Ламберта-Бугера-Бера: поглощение света прямо пропорционально концентрации вещества в растворе и зависит от толщины слоя (толщины кювет, d). В фотометрии используют монохроматический свет (свет определенной длины волны, ).

Расчет концентрации вещества 1) по формуле (с использованием стандартного раствора, с известной концентрацией вещества); где С_о – концентрация опытной пробы; Е_о – экстинкция опытной пробы; С_ст - концентрация стандартной пробы; Е_ст - экстинкция пробы со стандартным раствором. 2) по калибровочному графику, который строят, используя стандартные растворы, содержащие различные известные концентрации вещества и сопутствующие им показания оптической плотности.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА ПЛАЗМЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ БЕЛОК + NaOH/CuSO₄ = сине-фиолетовый цвет, интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически. ^ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Нормальное содержание общего белка (общий белок крови = альбумины + глобулины + фибриноген) в сыворотке крови у взрослых - 65-85 г/л. Повышение концентрации общего белка сыворотки крови (гиперпротеинемия) характерно для: ревматоидного артрита, коллагенозов, бронхоэктатической болезни, миеломной болезни, гипериммуноглобулинемии, а также гипогидратации организма (рвота, понос) и венозного стаза;  Снижение концентрации белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) отмечается при: голодании, беременности, нефротическом синдроме (гломерулонефрит), хронических заболеваниях печени (гепатиты и циррозы), гастроэнтеропатиях, ожогах, раковой кахексии.

16