13 Дыхание микроогранизмов. Типы дыхания. Методы культивирования анаэробов.

Дыхание бактерий

Дыхание (или биологическое окисление) микроорганизмов представляет собой совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток.

Все физиологические процессы, такие как движение, рост и размножение, образование спор и капсул, выработка токсинов, могут осуществляться при постоянном притоке энергии. Микроорганизмы добывают энергию за счет окисления различных химических соединений: углеводов (чаще глюкозы), спиртов, органических кислот, жиров и т. д. Сущность окисления состоит в том, что окисляемое вещество отдает электроны, а восстанавливаемое получает их.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на облигатные (строгие) аэробы, облигатные анаэробы и факультативные (необязательные) анаэробы.

Облигатные аэробы (микобактерии туберкулеза и др.) живут и развиваются при свободном доступе кислорода, т. е. реакции окисления осуществляются у них при участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества энергии. Примером может служить окисление глюкозы в аэробных условиях:

С6Н12О6 + 6О2 → 6СО2 + 6Н2О + 2882,6 кД (688,5 ккал)

Существуют и микроаэрофилы, которые нуждаются в малых количествах кислорода (некоторые лептоспиры, бруцеллы).

Облигатные анаэробы (клостридии столбняка, ботулизма и др.) способны жить и размножаться только в отсутствие свободного кислорода воздуха. Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Так, при анаэробном разложении 1 моль глюкозы энергии выделяется значительно меньше, чем при аэробном дыхании:

С6Н12О6 → 2С2Н5ОН + 2СО2 + 130,6 кД (31,2 ккал)

Наличие свободного кислорода для облигатных анаэробов является губительным. Это связано с тем, что в присутствии кислорода конечным продуктом окисления органических соединений оказывается перекись водорода. А поскольку анаэробы не обладают способностью продуцировать фермент каталазу, расщепляющую перекись водорода, то она накапливается и оказывает токсическое действие на бактерии.

Факультативные анаэробы могут размножаться как при наличии молекулярного кислорода, так и при отсутствии его. К ним относят большинство патогенных и сапрофитных бактерий.

Процессы разложения органических веществ в бескислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют также брожением. В зависимости от участия определенных микроорганизмов и конечных продуктов расщепления углеводов различают несколько типов брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами; молочно-кислое, вызываемое молочно-кислыми бактериями; масляно-кислое, обусловленное масляно-кислыми бактериями и др.

Выделение тепла при дыхании микроорганизмов можно наблюдать при выращивании культур в сосудах, защищенных от потери тепла, - температура питательной среды будет постепенно повышаться. С выделением избыточного тепла при дыхании некоторых микроорганизмов связаны процессы самовозгорания торфа, навоза, влажного сена и хлопка.

Биохимические механизмы дыхания более подробно изложены в учебниках биологической химии.

Методы культивирования

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пас­теровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиоло­гическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Со­держимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают ана­эробы.

Физические методы:

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипя­тят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного мас­ла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Химические методы

1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пиро­галлол.

2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.

Биологический метод Фортнера

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну полови­ну засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растоп­ленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, ко­гда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

14 ферменты микроорганизмов, классификация, конститутивные и адаптивные ферменты. Ферменты агрессии. Значение ферментов для идентификации патогенных бактерий. Практическое использование микробных ферментов.

Ферменты - это вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой. Они являются биологическими катализаторами и играют важную роль в обмене веществ микроорганизмов

Ферменты микробной клетки локализуются в основном в цитоплазме, некоторые содержатся в ядре и клеточной оболочке.

Характерным свойством ферментов является специфичность действия, т. е. каждый фермент реагирует с определенным химическим соединением или катализирует одну или несколько близких химических реакций. Например, фермент лактаза расщепляет лактозу, мальтаза - мальтозу.

Ферменты микроорганизмов классифицируются на экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты, выделяясь во внешнюю среду, расщепляют макромолекулы питательных веществ до более простых соединений, которые могут быть усвоены микробной клеткой. Так, к экзоферментам относят гидролазы, вызывающие гидролиз белков, жиров, углеводов. В результате этих реакций белки расщепляются на аминокислоты и пептоны, жиры - на жирные кислоты и глицерин, углеводы (полисахариды)- на дисахариды и моносахариды. Распад белков вызывают ферменты протеазы, жиров - липазы, углеводов - карбогидразы. Эндоферменты участвуют в реакциях обмена веществ, происходящих внутри клетки.

У микроорганизмов различают также конститутивные и индуктивные ферменты. Конститутивные ферменты постоянно находятся в микробной клетке независимо от условий существования. Это в основном ферменты клеточного обмена: протеазы, липазы, карбогидразы и др. Индуктивные (адаптивные) ферменты синтезируются в клетке только под влиянием соответствующего субстрата, находящегося в питательной среде, и когда микроорганизм вынужден его усваивать. Например, если бактерии, не вырабатывающие в обычных условиях фермента амилазы, расщепляющей крахмал, засеять на питательную среду, где единственным источником углерода служит крахмал, то они начинают синтезировать этот фермент. Таким образом, индуктивные ферменты позволяют микробной клетке приспособиться к изменившимся условиям существования.

Наряду с ферментами обмена многие патогенные бактерии вырабатывают также ферменты агрессии, которые служат для преодоления естественных защитных барьеров макроорганизма и являются факторами патогенности. К таким ферментам относятся гиалуронидаза, дезоксирибонуклеаза, лецитовителлаза и др. Например, гиалуронидаза расщепляет межклеточное вещество соединительной ткани (гиалуроновую кислоту) и тем самым способствует распространению возбудителя в макроорганизме.

Выделение микроорганизмами различных ферментов определяет их биохимические свойства. Ферментный состав любого микроорганизма является достаточно постоянным признаком, а различные виды микроорганизмов довольно четко различаются по набору ферментов. Поэтому изучение ферментативного состава имеет важное значение для дифференциации и идентификации различных микроорганизмов.

. Практическое использование микробных ферментов Издавна человек использовал ферментативную активность дрожжей в пивоварении и виноделии. Применение ферментов в пищевой промышленности позволяет значительно интенсифицировать технологический процесс, повысить выход и улучшить качество готовой продукции. Ферменты, выделенные из определенных видов микроскопических грибов, используются в процессе изготовления пшеничного теста, что позволяет увеличить объем, пористость выпеченного хлеба, улучшить его свежесть, аромат, вкус. Ферментные препараты некоторых микроорганизмов применяют для ускорения процессов выделения соков из плодов и ягод.

С целью получения высококачественных кормов для сельскохозяйственных животных процессы микробного синтеза используются при силосовании зеленых трав; благодаря ферментативной активности дрожжей, размножающихся на отходах нефти (парафинах), получают белково-витаминные концентраты, которые являются ценным питательным веществом - их добавляют к грубым кормам для животных.

Ферменты позволяют некоторым микроорганизмам усваивать метан, и эти виды бактерий используют для борьбы с метаном в шахтах. Известно, что ферменты бактерий (в частности, сенной палочки) широко применяются в качестве биодобавок к стиральному порошку "Ока" и стиральной пасте "Био". Эти препараты удаляют белковые загрязнения, так как ферменты расщепляют белки до водорастворимых веществ, легко смываемых при стирке.

В медицинской промышленности с помощью ферментов микроорганизмов получают витамины, гормоны, алкалоиды.

15 питательные среды, назначение. Требования, предъявляемые к пит-ым средам. Классификация питательных сред. Специальные, элективные, дифференциально-диагностические среды, накопительные, консервирующие пит-ые среды.

Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Требования

1. быть питательными

2. иметь оптимальную концентрацию водородных ионов – рН

3. быть изотоничными

4. быть стерильными

5. быть влажными

6. обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом

7. быть по возможности унифицированным, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.

8. были прозрачными

Классификация сред

1. Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений.

2. Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.

3. Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.

4. Назначение

а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;

б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для возбудителя коклюша - кровь;

в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов

г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;

д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды - глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.