Вирусология общая

1. Вирусы. Основные свойства вирусов, отличающие их от всех остальных живых организмов. Группы критериев, используемых для классификации вирусов.

Вирусы — особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являющихся поэтому абсолютными внутриклеточными паразитами (А. И. Коротяев).

Основные свойства вирусов, по которым они отличаются от всех остальных жи¬вых существ, следующие:

1)Ультрамикроскопические размеры.

2)Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа — или ДНК, или РНК.

3)Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4)Вирусы размножаются путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты.

5)У вирусов отсутствуют собственные системы мобилизации энергии.

6)У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

7)В связи с отсутствием собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Средой обитания вирусов являются бактерии, клетки растений, животных и человека.

В основу классификации вирусов положены следующие категории:

• тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома;

• размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;

• наличие суперкапсида;

• чувствительность к эфиру и дезоксихолату;

• место размножения в клетке;

• антигенные свойства и пр.

2. Молекулярная структура вирусов. Вирион. Особенности упаковки нуклеокапсида. Особенности структуры генома вирусов. Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой.

Вирион- зрелая внеклеточная покоющаяся форма.

Вирус- внутрикетчная рзмнож форма.

Структура вириона:

Внутри-1)геном(суперспирализированная НК, может быть предст-на ДНК: 2-нитевая линейная, 1-нитевая нефрагментированная линейная-позитивная и негативная), 2 нитевая замкнута в кольцо. РНК форма: 2-нитевая линейная,1-нитевая нефраг-я линейная(+,-), 1 –нитевая фрагмен-я(+,-)

2) Капсид-белковая оболочка вокруг НК.

Типы симметрии капсида:

• Спиральная(отдел-й Б-капсомер,укладывается по спирали автомат-ки без затраты энергии)

• Кубический- равнобедренный треуг-к, сос-т из 5-75треуг=сложной фрмы-икосаэдр

• Бинарная- у бактериофагов(головка-кубичческого типа, хвостик-спирального)

Типы взаимодействия вируса с клеткой. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и ин-тегративный.

Простые вирионы представлены нуклеокапсидами(нукл+капсид)

У сложных вирионов есть 3-я стр-ра суперкапсид(билипидный слой (Фосфолипиды)-эукариотического происхождения и блеки рпонизывающие его вирусного происхождения(гемагглютинин, нейроминидаза))

Продуктивный тип — завершается обра¬ованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитоли-тическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).

Абортивный тип — не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.

Интегративный тип, или вирогения — характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой:

1) адсорбция , происх-д за счет конфигуративного соот-я белков вириона к рецепторам, находях-ся на повернхности эукор кл-ки

2) проникновение вируса в клетку- осущ 3 способами:

-рецепторно опосредованный эндоцитоз(как простым, так и сложным) в месте адсорбции-инвагинация мембраны=>окоймленная ямка=>окоймленный пузырик

Свойсвенно только сложным

-пиноцитоз-суперкапсид вириона сливается с ЦМ=> нуклеокапсид оказывается в цитоплазме

-фагоцитоз лейкоцитами вириона

3) депротеинурия (разрушение Б)-разрушение капсиды, высвобождение НК;

4)размножение(репликация-воспроиз-е генома, транскрипция-ситез иРНК,трансляция-синтез Б);

5)сборка-автоматическая-без затраты энергии- уклад-ся белка,кубические с затратой энергии.

6)выхд из клетки:

-простые вирионы выходят путем разрыва ЦПМ

-сложные-путем почкования,модифицируют фрагмент мембрану, окружают его и выходят, при этом получая суперкапсид.

3. Строение бактериофагов. Взаимодействие Т-фагов с микробной клеткой (адсорбция, проникновение фаговой ДНК в клетку, размножение фага и выход его из клетки). Лизогения и лизогенная конверсия, механизм. Практическое использование фагов в медицине.

Бактериофаги— вирусы бактерий. Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушени¬ем.

Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка — икосаэдр, хвостик — спиральная симметрия). Фаги различаются по форме — нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам — мелкие, среднего размера и крупные. Чем крупнее фаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл.

Лизогения и лизогенная конверсия, механизм.

Жизненный цикл фага может проявляться в форме продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее), редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной) и абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клеткой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.

Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции.

Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки-хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.

Взаимодействие Т-фагов с микробной клеткой:

1)Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфиче¬ских рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, ши¬па или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом.

2)Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматиче- скую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).

3)Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации со¬держащейся в геноме информации:

4)Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.

5)Сборка вновь синтезированных вирионов — заключение геномной НК в бел¬ковую оболочку, морфогенез фагов.

6) Выход вновь синтезированных фагов из клетки:

а) путем отпочковывания;

б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вы¬зывает гибель клетки.

Практическое применение фагов. Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги мо¬гут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболе¬ваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонел- лезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Фаги широко использу¬ют для изучения генетики микроорганизмов.

4. Методы культивирования вирусов. Заражение животных, куриных эмбрионов. Получение культур клеток. Среды, применяемые для культур клеток. Цитопатический эффект и его проявления. Реакция гемадсорбции.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей живот¬ных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывает¬ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен¬ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра¬няются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготов¬ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю¬щих способностью длительно размножаться in vitro в определен¬ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам¬ниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоид¬ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе¬му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу¬емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло-качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опу¬холевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), кото-рое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорби¬ровать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее по¬становки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На по¬верхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инку¬бации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса при¬нимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных ви¬русных частиц является метод бляшек.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно вы¬сокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздей¬ствиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ря¬да вирусов в диагностических целях, а также для приготов¬ления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим из¬менениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его обо¬лочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность об¬наружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очист¬ку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препа¬ратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность живот¬ных к определенному вирусу и их возраст определяют репродук¬тивную способность вирусов. Во многих случаях только ново¬рожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в воз¬можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуциру¬ются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся кон¬таминация организма подопытных животных посторонними ви¬русами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данно¬го вируса, что удлиняет сроки исследования.

5. Особенности размножения вирусов, геном которых представлен однонитчатой ДНК. Репликативная и промежуточная репликативные формы. Особенности размножения вирусов, геном которых представлен однонитчатой РНК.

Однонитевая ДНК. Ее репликация происходит через образование вначале репликативной формы, а затем промежуточной репликативной формы. Репликативная форма возникает в результате синтеза на исходной вирионной ДНК («+» нити) ком¬плементарной ей «—» нити, т. е. однонитевая ДНК превращается в двунитевую структуру ДНК. Промежуточная репликативная форма — это репликативная форма, «—» нить которой служит матрицей для синтеза «+» нити ДНК, идентичной исход¬ной вирионной ДНК. Такой механизм обеспечивает передачу генов дочерним вирио- нам (рис. 80.1).

У вирусов, геном которых представлен однонитевой РНК, ее репликация про¬исходит по следующей схеме: вначале на вирионной РНК (вРНК) синтезируются комплементарные ей РНК (кРНК). Этот процесс катализируется специфической РНК-репликазой I. Затем на кРНК синтезируется комплементарная ей, но идентич¬ная исходной вирионная РНК (вРНК), этот процесс также катализируется специфи¬ческой репликазой И. Таким образом, репликация идет по схеме:

вРНК > кРНК > вРНК.

Общие закономерности размножения вирусов.

Во-пер¬вых, все РНК-содержащие вирусы, кроме вирусов гриппа и ретровирусов, размножа¬ются в цитоплазме. Для своего размножения вирусы гриппа А и В и ретровирусы проникают в ядро, что связано с особенностями поведения их генома. Во-вторых, размножение всех ДНК-содержащих вирусов, кроме вирусов оспы, протекает в ядре, где происходит транскрипция и репликация их геномных нуклеиновых кислот, и в цитоплазме, где происходит трансляция вирусных белков, их процессинг и мор¬фогенез вирионов. Лишь размножение вирусов группы оспы происходит в цитоплаз¬ме клетки, поскольку они обладают собственными системами транскрипции