4.8. Проведение тестирования безопасности наноматериалов

In vitro с использованием клеточных культур

4.8.1. Подготовка клеточных культур и образцов наноматериалов к тестированию и внесение

образца наноматериала в культуру

4.8.1.1. Исследования безопасности наноматериалов in vitro проводятся как на первичных, так и

на перевиваемых клеточных культурах. В случае использования перевиваемых клеточных линий

допускается использование только стандартизированных культур, полученных из аккредитованных

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

источников.

4.8.1.2. В случае использования первичных клеточных культур они должны быть получены из

здоровых половозрелых животных, прошедших карантин в течение не менее 10 дней. Можно

использовать как линейных (мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейных животных. В

случае использования линейных животных необходимо указать линию животных.

4.8.1.3. Для получения первичных клеточных культур используют стандартные методики,

рекомендованные для конкретного вида клеток и приведенные в разделе 4.7.1.

    4.8.1.4. Для унификации исследований первичные и перевиваемые

клеточные

культуры   (в   дальнейшем  именуемые  клетки-мишени)  на 

протяжении  всех

экспериментов  культивируют в стандартных условиях (при 37 °C, 5% CO 

и 95%

                                                                    2

влажности),  в  стандартных  питательных  средах,  которые 

рекомендованы в

паспорте  культуры  для  каждого конкретного вида клеток. Среды

стерилизуют

холодной фильтрацией через фильтры 0,22 микрон. При подготовке

перевиваемых

клеточных культур к экспериментам используют стандартную методику

пересева,

изложенную в разделе 4.7.2.

4.8.1.5. Непосредственно перед экспериментом клетки стандартизируются по концентрации

(рекомендованной для конкретного метода и вида клеток) с помощью подсчета клеток в камере

Горяева с использованием 0,5% раствора трипанового синего в ФСБ. Разброс по концентрации

клеток в сравниваемых группах не должен превышать +/- 10%. Количество повторов в группе

должно быть не менее 5, чтобы можно было оценить статистическую достоверность результатов.

    4.8.1.6.  Количество  вносимого  наноматериала  рассчитывают на

куб. см

полной питательной среды. Для выражения количества наноматериала

используют

единицы  массы  наноматериала  (мг). Дополнительно для выражения

количества

наноматериала  можно  использовать  такие  параметры,  как  число 

частиц в

                                        -3

единице  объема  питательной  среды  (см  )  или  общая площадь

поверхности

частиц в единице объема питательной среды (кв. м/куб. см).

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

4.8.1.7. Наноматериалы, предоставленные для тестирования в сухом виде (в виде порошков)

диспергируются в соответствующей питательной среде. Допускается использование только

физических методов диспергирования (встряхивание, перемешивание, обработка ультразвуком).

Использование детергентов и органических растворителей для диспергирования наночастиц в общем

случае не допускается.

4.8.1.8. Если наноматериалы находятся в растворителе или на носителе или растворитель или

носитель необходим для получения их дисперсий, то в отдельном ряде тестов проводятся

исследования цитотоксичности самого растворителя (носителя), который также добавляется в среду

культивирования в той же дозировке, что и в составе исследуемого образца наноматериала.

4.8.2. Ход тестирования

4.8.2.1. Общая продолжительность воздействия наноматерналов на клетки-мишени варьирует в

зависимости от вида клеток-мишеней и типа экспериментов и может составлять от 24 часов до 14

дней (для непролиферирующих и слабопролиферирующих клеточных культур), при этом учитывается

жизнеспособность клеток, изменение их пролиферативной способности и функциональной

активности.

4.8.2.1. Подбор концентраций наноматериала, вносимого в культуру, осуществляется на основе

предварительной информации производителя. Используемый диапазон концентраций (доз)

тестируемого материала должен перекрывать не менее трех порядков величины, начиная от

недействующих концентраций и до концентраций, вызывающих стойкие изменения в клетках и (или)

их гибель.

4.8.2.2. Если из-за низкой цитотоксичности испытуемого наноматериала не детектируется

гибель клеток или снижение их жизнеспособности и функциональной активности, то в отчете о

тестировании указывается максимальная и минимальная дозы наноматериала, которые были

добавлены в среду культивирования.