10.3. Гендерді өсімдіктерге тасымалдау әдістері

Қосжарнақты өсімдіктерге агробактериялардың ауру жұқтыруы табиғатта кең таралған құбылыс. Практикада өсімдік клеткаларының трансформациясын in vitro өткізген қолайлы. Т-ДНҚ жүйесін қолданып бүтін өсімдіктер мен протопластарда көптеген эксперименттер жасалған. Трансформацияланған кейбір өсімдіктердің ұрпақтары алынған. Оларға бөтен ген енгізу арқасында пайда болған жаңа қасиеттер Мендель заңы бойынша тұрақты тұқым қуалайды. Вируленттік агробактерияларды протопластармен аралас бірге өсіргенде трансформация өту үшін клетка қабығынын қайта құрылуы кажет. Бұл құбылыс клетка қабығының түзілуін тежейтін заттарды қолдану және де бактериялардың протопластарға қосылуын тежейтін ЭДТА қолдану арқылы дәлелдеген. Қара алқа протопластарын А.rhizogenes бактериясымен бірге өсіргенде жақсы нәтиже алынған. Трансформацияланған каллустардың 70%-нен регенерант өсімдіктер шыққан.

Бұл әдістің модификациясы, ол протопластарды бактериялардың сферопластарымен (қабығы жоқ) бірге өсіру. қызғылт қабыршөптің (барвинок розовый) протопластары агробактериялардың октопиндік Ті-плазмидасы бар сферопластарымен ГТЭГ және поливинил спирті көмегімен қосылған. Одан кейін протопластар гормондары жоқ қоректік ортаға көшірілген. Өсіп шыққан клетка колонияларында октопиннің түзілетіндігі анықталған, яғни клетка хромосомаларының құрамында Т-ДНҚ болғандығы дәлелденген. Осы бағытта протопластарға ПЭГ көмегімен Т-ДНҚ тікелей енгізу тәжірибелері жасалған. Трансформацияланған клеткалар гормондары жоқ ортада өсіріліп сұрыпталған.

«Жалаңаш» ДНҚ протопластарға тасымалданғанда, оны қорғау үшін ДНҚ-ны лизосомаларға (фосфолипидтерің шар тәрізді жасанды денешіктері) салады, әйтпесе клеткадағы нуклеаза ферменттері оны ыдыратып жібереді. Протопластар фюзоген көмегімен липосомалармен онай қосылады немесе эндоцитоз арқылы олардың ішіне сіңеді. Бұл әдіспен ДНҚ-ны клеткаларға қай өсімдік түрі болса да енгізуге болады.

Канамицинге төзімділік гені бар плазмида теріс заряды бар липосомаларға салынып, ПЭГ көмегімен темекінің мезофильдік протопластарымен қосылған. Канамицинге төзімді клеткалардан трансформацияланған регенерант өсімдіктер алынған. Бұл әдістін артықшылығы, арнайы ДНҚ молекуласын құрастырудың қажеті жоқ, ал кемістігі - трансформациялану жиі өтпейді.

Бұл әдістің тиімділігін арттыру жолы бар, ол электропорация, яғни клетка мембранасын электрлік тоқпен тесу. Көптеген зерттеушілер жоғары кернеуі бар (1-2 кВ/см) өте қысқа мерзімде (10-3 сек) өтетін разрядты қолданады. Электропорация әдісімен гендер қосжарнақты өсімдіктердің (темекі) және де даражарнақты өсімдіктердің (жүгері) протопластарына тасымалданған. Тасымалдау нәтижесін бір-екі тәуліктен кейін байқауға болады. Электрошоктан тірі қалған клеткалар антибиотикке төзімді келеді.

Осы әдістермен протопластарға ДНҚ енгізілгенде, өсімдік геномына оның бірнеше көшірмелері тіркесуі мүмкін. Шамасы, олар хромосоманың бір сайтына (белгілі жеріне) орналасады. Протопластардан регенеранттарды алу кейде қиын болады, сондықтан электропорация әдісін қолданып бүтін клеткаға бөтен генді енгізу тиімді көрінеді. Мысалы, темекінің мезофилл клеткаларына электропорацияны қолданып темекі теңбіл кеселі вирусының (ТТВ) РНҚ-сы енгізілген. Әсіресе бұл әдісті пісіп жетілген тозаң клеткаларына қолдану тиімді. Бүтін өсімдіктерге бөтен ДНҚ енгізу (түйінге инъекция жасап немесе тозаң аркылы) тәжірибелері нәтиже берген жоқ. Сондықтан өсімдіктердің трансформациясын табысты өткізу жолында ізденістер жалғастырылды.

Жануар клеткаларының трансформациясы микроинъекция аркылы нәтижелі өтеді. Өсімдік клеткаларына ДНҚ ерітіндісін күю техникалық жағынан едәуір қиын. Ол үшін сыртқы диаметрі 2 мкм инелер мен арнаулы микроманипулятор қолданылады. Әрбір протопластқа инъекция жасалатын ДНҚ ерітіңдісінің көлемі 10* - 10~⁹ мл болады. Темекінің жапырақ мезофилінің және каллустың протопластарына канамицинге төзімділік гені бар плазмидалар инъекция арқылы енгізілген. Содан кейін протопластар 0,5 - 1,0 мм микроколониялар болып көбейгенше әдеттегі ортада өсіріледі, кейін канамицины бар селективтік ортаға көшірілген. Алынған төзімді клеткалар линияларының геномында енгізілген бөтен ДНҚ фрагменттері болғандығы блот-гибридизация әдісімен анықталды. Бұл тәжірибе көрсеткендей, микроинъекция әдісі өсімдік клеткаларын трансформациялау үшін нәтижелі, әсіресе тура ядроға жасаған микроинъекция. Физикалық әдістері (электропорация, микроинъекция) ДНҚ, көп мөлшерде тасымалдауға мүмкіндік береді, ал векторларды қолданғанда ДНҚ көлемі шектеледі.

Трансформация әдісінің тағы бір түрі - хромосомалық инженерия. Ол бір мезетте көптеген тіркескен гендерді бірге тасымалдауға жол ашады. Бұл бағыттың маңызы, өсімдіктердің құнды қасиеттері мультигендік, яғни көп гендермен кодталатын болады. Жоғарыда аталған әдістердің кемшілігі, ол протопластарды бөліп алу, өсіру, регенеранттар алу (әсіресе астық тұқымдастарында) қиыншылықтары. Регенерация процесі ұзаққа созылатындықтан, өсіп шыққан өсімдіктерде мутациялар, хромосомалар құрылысында өзгерістер болуы әбден мүмкін.

Сонымен, генетикалық информацияны өсімдікке енгізу әдістері аз емес, және де оларды жетілдіру жұмыстары жалғасып жатыр. Осы бағыттағы соңғы бір жетістік - «жапырақ бөлшегі» әдісі. Ол бүтін өсімдіктің деңгейінде гендер экспрессиясын анықтауды жеңілдетеді және тездетеді. Бұл әдісте аэробактериялардың гендерді тасымалдау қабілеті эксплант ретінде қолданатын жапырақ бөлшектерінің регенерацияға қабілетімен сайма-сай келеді. Бүл әдіс темекіде, томатта, дарбызда сынап көрілген.

Темекінін жапырақ дисктеріне (дөнгелек бөлшектеріне) ісік туғызатын қабілеті жоқ Ті-плазмидасының құрамында канамицинге төзімділік гені бар А.tumefaciens штамын жұқтырған. Жапырақ дискілері Петри табақшаларында екі күн бойы бактериялармен бірге өсірілген. Кейін олар 50 мг/л канамицині бар селективтік ортаға көшірілген. Дисктерде жапырақ регенерациясы 2-4 апта өткен сон басталады, 4-7 аптадан кейін тамырлар пайда болады. Канамицин бар ортада өскен трансформанттардын геномында Т-ДНҚ, бары блот-гибридизация әдісі арқылы дәлелденді. Бұл әдістің артықшылығы, гендердің тасымалдануы, өсімдіктер регенерациясы және трансформанттар селекциясы бір жүйеде жалғаса өтуі. Бұл әдіс агробактериялар жұқтыратын және жапырақтан регенерациясы жүретін өсімдіктердің барлық түрлеріне жарамды.

С. Өмірүлы мен М. Қарабаев жүгеріні генетикалық трансформациялау жүргізудің тиімді жүйесін жете зерттеп дайындады. Ол эмбриогендік протопластарға тікелей ДНҚ, енгізу арқылы ұрықтана алатын регенеранттарды алуға негізделген. Вектор ретінде рМGРІ және рN29 плазмидалары пайдаланылған. Оларға қолдан жасалған промотор тігілді. Ол промотор бидайдың a-амилаза генінің қысқартылған промоторынан және ТКТВ 35 S промоторынын қос энхансерлік элементінен құрастырылған еді. Жүгері клеткаларына тасымалданатын негізгі ген, ол B-глюкуронидаза ферментінің құрылымдық гені болған (GUS-ген). Бұл фермент көптеген глюкуронидтерді ыдыратады. Векторлардың құрамында селективтік маркер ретінде неомицин-фосфотрансфераза мен фосфотрицин-ацетилтрансфераза гендері болған. Бірінші фермент неомицин тектес антибиотиктердің активтігін тежеген (мысалы, канамициннің), екіншісі -фосфотрицин гербицидтің активтігін тежеген. Сондықтан, бұл гендер бар клеткалар антибиотик пен гербицид қосылған ортада тірі қалған, яғни трансформацияланған клеткаларды сұрыптауға мүмкін болған. Эмбриогендік клеткалар суспензиясынан алынған протопластарға ПЭГ көмегімен рекомбинанттық ДНҚ, енгізілген. Трансформанттарды кейін канамицин мен фосфотрицинге төзімділігі арқылы сұрыптаған. Клеткаларды х-gluc бояумен өңдегенде, трансформацияланғандары GUS–гені көмегімен сол затты ыдырату нәтижесінде көк түсті болып шыққан. Боялған клеткалар мен колониялардан регенерант өсімдіктер алынған. 11 млн протопластардан (4 г клеткалар суспензиясы) 140 трансгендік өсімдіктер алынған. Олар нормалы өсімдіктер болған, басым көпшілігінде морфологиялық өзгерістер немесе дамуында ауытқулары болмаған. Айқас тозаңданудан кейін олардан құнды ұрықтар алынған. Тасымалданған гендер тұқым қуалаған, келесі буындарда GUS-гені бар және

GUS -гені жоқ өсімдіктер болған. Жүгері өсімдіктерінің әр түрлі ұлпаларында (жапырақ, сабақ, тамыр) Си8-геннің экспрессиясы гистохимиялық, әдісімен зерттелді. Сонда жас жапырақтар, жапырақтағы түтік шоқтардың қоршау клеткалары, эпидермис және мезофилл клеткалары, сабақ түтік шоқтары, тамыр оймақшасы және тамыр түтік шоқтары көк түске боялды. Осы тәсілдерді қолданып клеткалық денгейде бидайдың тұрақты генетикалық трансформанттары алынды. Бұл жұмыс астық тұқымдастар клеткалары мен өсімдіктерін генетикалық өзгерту және қайта құрастыру үшін биоинженерия әдістерін қолдануға болатындығын көрсетті.