36. Физиолого-биохимические процессы у иммобилизованных растительных клеток и их отличия от суспендированных (свободных) клеток.

Иммобилизованные растительные клетки заметно отличаются по своим физиологическим свойствам от интактных.

• скорость роста иммобилизованных клеток в целом ниже, чем в суспензии, хотя возможная утечка клеток из матрикса затрудняет интерпретацию результатов.

• содержание хлорофилла в иммобилизованных клетках более высокое по сравнению со свободными, что, правда, может быть связано с частичным уменьшением освещенности в иммобилизованных препаратах.

• Изучение скорости фотосинтетического выделения кислорода выявило его увеличение втрое у иммобилизованных в Са-альгинате клеток Botryococcus по сравнению со свободными. В то же время у иммобилизованных в альбуминглутаральдегидальгинатном геле клетках Scenedesmus скорость фотовыделения кислорода была только на 5 % выше, чем в суспензии, что, возможно, объясняется токсичным влиянием глутаральдегида.

• Еще один параметр физиологической активности клеток – интенсивность дыхания. Средняя скорость дыхания иммобилизованных в Са-альгинате клеток Chlorella была ниже, чем в суспензии, причем среднее значение зависело как от размера частиц матрикса, так и от концентрации клеток внутри матрикса. Эти исследования позволили предположить, что только часть клеток в гранулах сохраняла метаболическую активность. Интенсивность дыхания иммобилизованных в Са-альгинате клеток Catharanthus roseus почти в 2 раза ниже, чем в тех же клетках после растворения полимерного матрикса. Объясняют это явление диффузионными затруднениями внутри матрикса.

• Электронно-микроскопические исследования роста и морфологии иммобилизованных клеток водорослей показали, что иммобилизация в полиуретане мало изменяет их морфологию. Включение клеток в Са-альгинатный гель вызывает появление складчатости у Chlamydomonas, значительное ограничение роста клеток Chlorella на периферии гранул. Предположительно, это происходит вследствие ограничения доступа СО₂ внутрь матрикса. Иммобилизованные в альгинате колонии Botryococcus имели более регулярную форму и в 2,5 раза больший размер по сравнению со свободными клетками. Клетки Solanum aviculare, включенные в Са-альгинатный гель, не только приобретали округлую форму по сравнению со свободными клетками, но и образовывали более многочисленные колонии.

Цитологические исследования Euglena c использованием трансмиссионной электронной микроскории продемонстрировали, что иммобилизация в Са-альгинате и хранение гранул в темноте при 4 ⁰С в 0,1 М СаСl₂ стабилизировали клетки в одном и том же состоянии на протяжении нескольких лет. Таким образом, иммобилизованные клетки могут успешно использоваться для долговременного хранения штаммов в коллекциях культур.

37. Приемы выделения и введения в культуру клеток животных.

Типы животных клеток, которые введены в культуру in vitro:

1. - элементы соединительной ткани (фибробласты, лимфоциты, моноциты, макрофаги);

2. скелетные, сердечные и гладкие мышцы;

3. эпителиальные ткани (печень, легкие, почки и др.);

4. клетки нервной системы;

5. эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса);

6. -различные опухолевые клетки

Клеточные культуры:

1.Первичные культуры (могут быть получены практически из любого органа, однако даже при систематической смене питательной среды существуют лишь до первого пересева).

2.Диплоидные (эмбриональные) культуры (получают из эмбриональных тканей человека и животных, сохраняют способность к делению и диплоидный набор хромосом до 50 субкультивирований)

3.Стабильные (перевиваемые) линии (получают из нормальных и раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время; полностью адаптированы к существованию вне организма)

Получение культуры животных клеток

1)Изолированные клетки получают, подвергая образцы тканей ферментативному диспергированию (трипсин); 2) Клетки ресуспендируют в питательной среде;

3) Нормальные клетки растут в виде монослоя на поверхности культурального сосуда, трансформированные клетки не образуют монослой.

Животные клетки гораздо сложнее культивировать in vitro по сравнению с микроорганизмами по следующим причинам:

1. Требуются сложные по составу питательные среды.

2. Клетки очеyь чувствительны к механическим воздействиям.

3. Рост клеток происходит преимущественно после прикрепления к поверхности.

4. Низкая скорость роста (время удвоения гораздо выше по сравнению с бактериальными культурами).