42.Биотехнология: сырьевая база, основные объекты и способы получения целевых продуктов биотехнологических процессов. Успехи и перспективы современной б/т.

Термин был введен Карлом Эреки и относился к крупномасштабному получ. свинины (конечный продукт) с исп. дешевой сахарной свеклы (сырье) в качестве корма для свиней (биотрансформация). По Эреки б/т — это «все виды А, при кот. из сырьевых материалов с помошью живых организмов производятся те / иные продукты». Потом, б/т оказалась четко и необратимо св. с иссл-ми в области «промышленного произв-ва товаров и услуг при участии живых организмов, б/т с-м и пр-сов». Промышл. б/т пр-с, в кот. для произв. коммерч. продуктов исп. м/о, обычно сост. из 3 ключ. этапов.

1.Исх. обработка: обр. сырья т. о., чтобы его м. б. исп. как ист. пит. в.в для микроорганизма-мишени.

2.Ферментация и биотрансформация; рост м/о-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (ферментация) с последующим обр. нужного метаболита, напр. а/б, а.к. / Б (биотрансформация).

3.Конечная обработка: очистка нужного в-ва от компонентов культуральной среды / от кл. массы.

Целью б/т исследований явл. макс. ↑ эффективности каждого из этих этапов и поиск м/о, с помощью кот. м. получить нужные вещества (пищевые добавки, антибиотики и т. д.).

Биообъект способен осущ. опр. модификацию исх. сырья и обр. тот / иной необх. продукт. В качестве объектов б/т м. выступать кл. м/о, жив. и раст., трансгенные жив. и раст., а также многокомпонентные ферментные с-мы кл. и отельные Ф. Модельные м/о – это немногочисленная, но глубоко изученная гр. м/о: E.coli, Bac.subtilis.Во многих б/т процессах исп/ ограниченное число м/о, кот/ классифицируются как GRAS (generally recognized as safe – обычно считаются безопасными). Эти м/о непатогенные, нетоксичные и в основном не образуют а/б, поэтому при разработке нового б/т процесса следует ориентироваться на данные м/о, как на базовые объекты б/т. В наст. время охарактеризовано > 100 в. м/о, поэтому важной проблемой явл. - правильный выбор из такого разнообр. именно того м/о, кот. спос. обесп. получ. треб. продукта, т.е. спос. сл. промышл. цел. Требования к производству: экономическая эффективность, сырье для данного биотехнологического процесса, знание физиологии организмов биотехнологии.

Этапы и уровни производства. Исходное сырье → культивирование биологических объектов → конечный продукт. Исходное сырье – предферментационная стадия (сырье должно быть предварительно очищено и подготовлено), только после этого оно используется для объекта. Для культивирования надо биологические объекты и ферментеры. Конечный продукт должен пройти стадию постферментативной обработки.

Биологические объекты:

1. Клетки микроорганизмов

2. Клетки грибов, дрожжей, водорослей и простейших.

3. Трансгенные организмы и многокомпонентные системы с использованием иммобилизованных клеток и ферментов.

Требования к биологическим объектам:

1. Способность к росту на дешевых питательных средах

2. Высокая скорость роста, высокий выход целевого продукта, экономическая эффективность процесса биосинтеза продуктов

3. Минимальное образования побочных продуктов, а также соединений, которые обладают токсическими и аллергическими действиями.

4. Высокая конкурентоспособность.

Процесс культивирования проходит:

1. В условиях строгой стерильности

2. В многофазной системе; свойства этой системы могут меняться.

3. Образование конечных продуктов сильно зависит и определяется различными видами регуляции биологических продуктов

4. Исходная концентрация веществ и товарных форм являются низкими.

5. Скорость роста биологических объектов и скорость образования целевых продуктов не совпадают.

43.Генная инженерия. Методы клонирования генов. Векторные системы, использующиеся при клонировании генов.

Генная инженерия — раздел молек. генетики св. с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осущ. контроль за синтезом необх. метаболитов кл. Возникнув на стыке химии НК и генетики м/о, она занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из кл. живых организмов / вновь синтез-ных генов в кл. раст. и жив. с целью направленного изменения их наследственных свойств.

ВЕКТОРЫ для м/о: из плазмидной ДНК (pBR322) и из ДНК фагов (λ). На осн. ssДНК фагов: F1, F2, fd. Исп. для опр. последовательности нуклеотидов. В цикле их разв. обр. ds – формы, потом → ss.

Грам «+» (Bacillus) обл. собственными плазмидами, кот. не несут селективные маркеры. Поэтому исп. плазмиды Stafillococus, кот. несут устойчивость к а/б и экспрессируются в бациллах (pUB110, pAC194). Они мультикопийны, небольшого размера, индуцируются при добавлении а/б.

КЛАССИФИКАЦИЯ ВЕКТОРОВ:

• по целевому назначению – для амплификации гена, для секвенирования, для экспрессии гетерологичной ДНК и секретирующие (грам «+») – к Б пришивается сигнальная последоват-сть.

• прямой и непрямой селекции:

- прямая - вставка в ген приводит к его инактивации (подавл. способность с синтезу бактерицинов)

- непрямая – обладает новыми признаками (а/б устойчивость, изм. морфология).

ВЕКТОРЫ для эукариот: на основе ДНК хлоропластов, митохондрий и вирусной.

Для животных вектора на осн. вируса SV40. Дефектный вирусный геном внедряется в геном клетки и способен только продуцировать вирусные белки, в то время как сами вирусы не продуцируются, вследствие нарушенной репликативной функции. Однако если в трансформированную таким образом клетку внести рекомбинантную ДНК вируса SV-40 с ненарушенной репликативной системой, содержащую к тому же вставку из интересуемой ДНК, то начнется репликация рекомбинантных вирусных плазмид в больших количествах. Они, оставаясь внехромосомальными, накапливаются в количествах до 100 тысяч на клетку, одновременно происходит транскрипция интересуемой ДНК-вставки с образованием мРНК и синтез целевого белка в результате трансляции.

Для растений – Ti-плазмиды. От Agr. tum, специфический Т-участок кот. сп. вкл. в кл. двудольных раст. и внедряться в их Я ДНК, что ведет к обр. специф. опухолей (галлов); содержит гены, контрол. синтез редких а.к. (опинов) – октопина, нопалина, агропина.

Для насекомых – бакуловирусы + ген полиэдрина (бакмиды для E. coli и насекомых).

ВЕКТОРЫ для дрожжей: на основе бактериальной и дрожжевой плазмид (2 микронная).

Рекомбинантная ДНК – любой вектор со вставкой.

Способы выделения гетерологичной ДНК.

1) «шот-ган» - ДНК делят на фрагменты (рестриктазы, физ. возд.), затем соед. с вектором.

2) хим. синтез ДНК – нужно знать конечный продукт, кот. д.б. небольших размеров.

3) получение кДНК – так м. получить ДНК опр. органов и тк.; м. получить ДНК опр. стадии ЖЦ.

Соединение вектора и ДНК.

Соед. комплементарных концов требует наличия АТФ, ионов Mg. Приемы:

1. с помощью линкеров и адаптеров – исск. синтез. мол. ДНК, кот. им. сайты для 1 / неск. рестриктаз.

2. коннекторов – послед-ти ДНК, комплементарные др. др. (поли Т –вектор, полиА – гетеролог. ДНК).

Реципиентная кл. выполняет 2 функции:

1) хозяин для рекомбинантной ДНК;

2) хозяин для наработки и получения целевого продукта.

44.Строение и химический состав вирусных частиц и б/фагов. Вирусы относятся к царству Vira. Они не им. кл. строения, белоксинтезирующей си-мы, сод. только 1 тип НК (ДНК/РНК). Они – автономные генетические стр-ры, отличаются особым разобщенным способом размножения (репродукции): в кл. отдельно синтезируются НК и Б вируса, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Вирусы – облигатные внутрикл. паразиты, размножаются в ЦП / Я кл. Полностью сформированная инфекционная частица – вирион. Форма фирионов м. б. различной: палочковидной (ВТМ), пулевидной (бешенства), сферической (полиомиелита. ВИЧ), в в. сперматозоида (многие б/фаги). Один из самых мелких вирусов – вирус полиомиелита (ок. 20 нм), самый крупный – вирус натуральной оспы (ок. 350 нм). Различают ДНК- (дезокси-)и РНК-содержащие вирусы (рибовирусы). Геном содержит от 6 до неск. сотен генов. Вирусы подразделяют на просто устроенные (полиомиелита и др.) и сложно (гриппа, кори, герпеса). У просто устроенных НК, составляющая сердцевину вируса, св. с Б оболочкой – капсидом, который состоит из субъединиц – капсомеров. Из капсомеров образуются структуры с высокой степенью симметрии, способные кристаллизоваться. НК и капсид составляют нуклеокапсид. У сложно устроенных вирусов капсид окружен дополнительной липопротеидной оболочкой из ПМ кл-хозяина – суперкапсидом, или пеплосом. Вирионы им. спиральный (ВТМ - РНКсодержащий), икосаэдрический (кубический) (аденовирусы, папилломы, полиомиелита), и сложный тип симметрии капсида. Капсид и суперкапсид защищают вирионы от воздействия окр. среды, обусловливают избирательную адсорбцию вируса на определенных кл. Вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, растения и бактерии. Они являются основными возбудителями многих инфекционных заболеваний чловека, а также участвуют в процессах канцерогенеза. Кроме обычных вирусов известны и т.н. неканонические вирусы прионы – белковые инфекционные частицы. Прионы вызывают у чела и жвотных энцефалопатии в условиях медленной вирусной инфекции (болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру и др.). Др. необычными агентами, близкими к вирусам, являются вироиды – небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие Б и вызывающие заболевания растений. Содержат нуклеиновую кислоту только одного типа, репродуцируются в форме генного материала, лишены системы генерации энергии (абсолютные паразиты).

Каждая вирусная частица состоит из расположенного в центре носителя генетической информации и оболочки. Генетический материал представляет собой короткую молекулу нуклеиновой кислоты, это образует сердцевину вируса. Нуклеиновая кислота у разных вирусов может быть представлена ДНК или РНК, причем эти молекулы могут иметь необычное строение: встречается однонитчатая ДНК и двух нитчатая РНК. Оболочка называется капсид. Она образована субъединицами – капсомерами, каждый из которых состоит из одной или двух белковых молекул. Число капсомеров для каждого вируса постоянно (в капсиде вируса полиомиелита их 60, а у вируса табачной мозаики – 2130). Иногда нуклеиновая кислота вместе с капсидом называется нуклеокапсидом. Если вирусная частица кроме капсида, больше не имеет оболочки, её называют простым вирусом, если имеется ещё одна – наружная, вирус называется сложным. Наружную оболочку также называют суперкапсидом, генетически она не принадлежит вирусу, а происходит из плазматической мембраны клетки-хозяина и формируется при выходе собранной вирусной частицы из инфицированной клетки. Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элементов, чаще всего принадлежат к группе простых вирусов, лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либо специализированных структур. Это вирусы растений, некоторые вирусы животных и насекомых. В то же время практически все бактериофаги, которые по химическому составу, принадлежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть вирусов этой группы паразитирует на животных. Вирусы вне организма активности не проявляют. Вирусы бактерий надо искать в местах обитания этих бактерий. Если речь идет о вирусах человека и животных то: - он может передаваться от человека к человеку (например, вирус оспы, то с ним можно вести борьбу).