5.1. Визначення активності аланінамінотрансферази (алт) і аспартатамінотрансферази (аст)

(за методом Рейтмана-Френкеля)

Принцип методу. Внаслідок переамінування, що відбувається під дією АЛТ і АСТ, утворюються щавлевооцтова і піровиноградна кислоти, які при додаванні 2,4-динітрофенілгідразину утворюють у лужному середовищі забарвлені гідразони, що мають максимум поглинання при довжині хвилі 500–560 нм.

Обладнання: фотоелектроколориметр (кфк-2, КФК-3) або спектрофотометр; водяна баня; пробірки; піпетки на 0,1; 1,0 і 5,0 мл.

Реактиви: 1) субстратний розчин АЛТ (або АСТ), чда: буфер – 0,1 моль/л рН 7,4±0,2; 2-оксоглутарат – 2 ммоль/л; DL-аланін (для АЛТ) або DL-аспартат (для АСТ) – 0,2 моль/л – 105 мл;

2) 2,4-динітрофенілгідразин, чда (1 ммоль/л в 1 моль/л HCl) – 105 мл;

3) стандартний розчин натрію пірувату, чда (2 ммоль/л) – 3 мл;

4) 0,4 М (16 г/л) розчин NaOH або 0,4 М (22,4 г/л) розчин KOH, чда.

Використовують набори реактивів НВФ “Simko Ltd” (м. Львів).

Хід визначення. У пробірку вносять 0,25 мл субстратного розчину АЛТ (АСТ), нагрівають при температурі +37 °С протягом 3–5 хв, додають 0,05 мл сироватки крові й інкубують (при +37 °С) точно 60 хв. Вносять 0,25 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину і витримують протягом 20 хв при кімнатній температурі. Додають 2,5 мл 0,4 М розчину натрію чи калію гідроокису, ретельно перемішують і витримують 10 хв при кімнатній температурі. Визначають оптичну густину при довжині хвилі 500–560 нм у кюветі з товщиною робочого шару 10 мм проти контролю. Аналогічно обробляють контроль – 0,05 мл ізотонічного розчину натрію хлориду.

Розрахунок активності ферментів у сироватці крові виконують за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіка. Із стандартного розчину нат-рію пірувату готують ряд розведень (табл. 14).

У кожну пробірку вносять по 0,5 мл розчину 2,4-динітро-фенілгідразину, струшують і витримують 20 хв при кімнатній температурі. Додають по 5 мл 0,4 М NaOH (KOH), ретельно перемішують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі. Визначають оптичну густину при довжині хвилі 500–560 нм у 10 мм кюветі проти контролю (пробірка № 5). На осі ординат відкладають знайдену величину оптичної густини, на осі абсцис – вміст піровиноградної кислоти калібрувальної проби, виражене у мккат/л або мкмоль/(год х мл).

Таблиця 14 – Розведення натрію пірувату

№ пробірки	Стандартний розчин натрію пірувату, мл	Ізотонічний розчин NaCl, мл	Субстратний розчин АЛТ/АСТ	Активність ферменту (АЛТ, АСТ)
				мккат/л	мкмоль/год  мл
1	0,05	0,1	0,45	0,28	1,0
2	0,1	0,1	0,40	0,56	2,0
3	0,15	0,1	0,35	0,83	3,0
4	0,2	0,1	0,30	1,11	4,0
5*	–	0,1	0,50	–	–

* – контрольна проба.

За калібрувальною кривою знаходять значення активності амінотрансфераз (АЛТ або АСТ) у сироватці крові.

Діагностичне значення. Аспарагінова (аспартатамінотрансфераза) та аланінова (аланінамінотрансфераза) трансферази локалізуються у гіалоплазмі клітин (АСТ, окрім того, у мітохондріях) більшості органів і систем. Трансферази не є специфічними для окремих органів, тому необхідно визначити точне місце елімінації ферменту в кров (скелетні м’язи, печінка, міокард тощо). Величини активності трансфераз у сироватці крові здорових тварин наведені у додатку Г. Дослідження активності АСТ та АЛТ у сироватці крові використовують для діагностики хвороб печінки (гепатиту, гепатозу та ін.). Для великої і дрібної рогатої худоби показовими є дослідження активності АСТ у сироватці крові, а для коней, свиней, собак і котів – АЛТ і AСT. Це пояснюється ступенем активності названих ензимів у гепатоцитах тварин різних видів. АСТ має високу активність у клітинах великих тварин, а АЛТ – дрібних. Трансферази є досить чутливими та інформативними показниками ураження печінки. Найвища активність трансфераз у крові спостерігається при розвитку некрозу печінки і гострому паренхіматозному гепатиті, дещо нижча – при хронічному гепатиті та гепатодистрофії. Зростання активності АСТ і АЛТ у сироватці крові починається за 3–8 днів до появи клінічних ознак захворювання і досягає максимуму в період гострого перебігу патологічного процесу. При розвитку жирової дистрофії печінки у корів зростання активності АСТ виникає вже при ультрамікроскопічних змінах органа, коли активність інших фер-ментів ще мало змінюється. Гіперферментемія залежить від кількості відкладеного жиру в паренхімі. Активність АСТ у крові корів, хворих на жирову гепатодистрофію, збільшується у 2–5 разів.