Матричные процессы в клетке.

Существуют три типа матричных процессов в клетках: репликация, транскрипция и трансляция.

Основное функциональное значение процесса репликации ДНК заключается в снабжении потомства генетической информацией, которая должна передаваться полностью и с очень высокой точностью.

Репликация – удвоение ДНК, происходящее в синтетическую (S) стадию интерфазы пред каждым делением клетки.

Консервативная репликация. Исходная двухцепочная молекула ДНК служит матрицей для образования совершенно новой двухцепочечной молекулы, нацело достраивающейся на исходной.

Полуконсервативная репликация. Две нити ДНК расплетаются (как застежка - молния). Каждая цепь служит матрицей для образования новой. При репликации молекула ДНК постепенно разделяется специальным ферментом на две половины в продольном направлении. По мере того, как открываются нуклеотиды разделяемой молекулы, к ним тут же присоединяются свободные нуклеотиды, раннее синтезированные в цитоплазме. В результате каждая половинная спираль снова становиться целой, и вместо одной молекулы получаются две, в результате чего хромосома становится двухроматидной.

Дисперсионная репликация. Исходная ДНК распадается на короткие разной длины фрагменты, используемы в качестве матриц для постоения фрагментов двух новых двойных спиралей, которые затем воссоздаются в единую структуру молекулы. Образованные молекулы ДНК содержат старые и новые фрагменты.

М.Мезельсон и Ф. Сталь, используя авторадиографический метод, показали, что полуконсервативный метод репликации характерен для всех эукариот и большинства прокариот.

В 1955 г. А. Корнберг и его коллеги из Стенфордского университета открыли фермент, который обеспечивает репликацию ДНК, и назвали его полимеразой.

На современном этапе среди ферментов, участвующих в синтезе ДНК, выделены ДНК-полимеразы I, II, III, обладающие 5’→ 3’ полимеразной активностью.

Поскольку ДНК- полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5’→ 3’, а цепи родительской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно. Эта цепь называется лидирующей. Вторая цепь, называемая отстающей, синтезируется в виде фрагментов ДНК – фрагменты Оказаки, которые у эукариот имеют последовательность 100-200 нуклеотидов. Эти фрагменты лигируются (сшиваются) полинуклеотидлигазами, и образуется непрерывная цепь. Этот процесс называется созреванием. Синтез каждого фрагмента Оказаки (3’→ 5’) начинается на маленьком фрагменте РНК (около 10-60 нуклеотидов), который удаляется еще до окончания считывания фрагмента. Это так называемая затравка, или праймер.

Транскрипция (переписывание) – синтез на ДНк-матрице мРНК (первичного продукта гена), осуществляющийся в ядре на смысловой нити ДНК, находящейся в релаксированном состоянии. Это первый этап белкового синтеза. Матричная РНК (мРНК) содержит генетическую инструкцию по синтез определенного полипептида и переносит ее к белоксинтезирующему аппарату клетки, находящемуся в рибосомах цитоплазмы клеток.

Для инициации транскрипции необходимо наличие специального участка в ДНК, называемого промотором. Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетание двойной спирали ДНК и образуется открытый промоторный участок.

Элонгация (удлинение) цепи РНК – это стадия транскрипции, которая наступает после присоединения 8 рибонуклеотидов. При этом движущаяся РНК-полимераза вдоль цепи ДНК действует подобно застежке молнии, раскрывая двойную спираль, которая замыкается позади фермента по мере того, как соответствующие основания РНК спариваются с основаниями ДНК.

Терминация (прекращение роста) цепи мРНК происходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами.

Процесс формирования зрелых молекул РНК из предшественников называется процессингом, в результате которого молекулы подвергаются модификации по 5’→ 3’ концам и сплайсингу. Сплайсинг гетерогенной ядерной РНК это удаление последовательностей РНК, соответствующих интронам ДНК, и соединение участков с транскрибируемыми последовательностями экзонов.

Трансляция (перевод) – процесс воплощения генетической информации мРНК в структуру полипептида. Это второй этап белкового синтеза, осуществляемый последовательной поликонденсацией отдельных аминокислотных остатков, начиная с аминоконца полипептидной цепи к карбоксильному концу.

Зрелая матричная РНК выходит в цитоплазму, где осуществляется процесс трансляции – декодирование мРНК в аминокислотную последовательность белка. Процесс декодирования осуществляется от 5’→ 3’ и происходит в рибосомах. Комплекс мРНК и рибосом называется полисомой.

Трансляция начинается со старого кодона АУГ, который при локализации в смысловой части структурного гена кодирует аминокислоту метионин. Каждую аминокислоту доставляет к полисоме транспортная РНК (тРНК), специфичная к данной аминокислоте. тРНК выполняет роль посредника между кодоном мРНК и аминокислотой. Молекулы тРНК узнают в цитоплазме соответствующий триплет (кодон в мРНК) по принципу спаривания комплементарных азотистых оснований. тРНК, которая подходит к малой субчастице, образует связь кодон – антикодон, при этом одновременно передает свою аминокислоту в аминоацильный участок (А-участок) большой субъединице. К кодону АУГ «подходит» антикодон только той тРНК, которая преносит метионин. Поэтому прежде всего к рибосоме доставляется метионин. Затем кодон АУГ переходит на пептидильный участок большой субъединицы (Р-участок). В результате этих процессов образуется транслирующая рибосома – инициирующий комплекс.

Терминация (окончание синтеза) происходит по команде кодонов УАА, УАГ, УГА. В природе не существует таких молекул тРНК, антикодоны которых соответствовали бы этим кодонам.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1984 г. Кэри Б. Мюллисом. Она основана на том, что новосинтезируемые цепи нуклеиновых кислот могут служить матрицами в следующих циклах репликации:

• двухспиральная ДНК при нагревании разделяется на состовляющие одноцепочные цепи и в таком состоянии может служить матрицей для репликации;

• одноцепочные нити ДНК инкубируются в присутствии ДНК-полимеразы и раствора, содержащего смесь всех 4 нуклеотидов, а также специфические последовательности ДНК (праймеры), что приводит к синтезу копий двух молекул ДНК.

Затем процедуры повторяются сначала, и происходит копирование как старых, так и новых одноцепочечных цепей с образованием третьей и четвертой молекулы ДНК, затем все четыре снова копируются и тд. В результате 20-30 циклов амплифицируется (увеличивается число копий) эффективное количество ДНК. Отдельный цикл занимает около 5 мин, а для бесклеточного молекулярного клонирования фрагмента ДНК требуется всего несколько часов.

Метод ПЦР отличается очень высокой чувствительностью: он позволяет обнаружить в пробе всего одну присутствующую в ней молекулу ДНК. Метод получил широкое использование в пренатальной диагностике наследственных болезней, выявлении вирусных инфекций, а также в судебной медицине, поскольку дает возможность проводить генетическую «дактилоскопию» даже по одной единственной клетке.