3.1. Лекарственная устойчивость бактерий и пути ее преодоления

Еще в начале развития химиотерапии при изучении действия фипанового синего на трипаносомы П. Эрлих заметил появление ре- мстентных форм микроорганизмов к данному красителю. По мере расширения арсенала химиопрепаратов увеличивалось число сообще­ний о таких наблюдениях. Так, после начала широкого применения сульфаниламидных препаратов было отмечено появление многочис­ленных штаммов бактерий, которые легко выдерживали терапевти­ческие концентрации данных препаратов.

Антибиотикорезистентные бактерии возникли и стали распрост­раняться сразу после внедрения антибиотиков в клиническую прак­тику. Как тревожный сигнал прозвучали сообщения о появлении и распространении пенициллинрезистентных стафилококков. В насто­ящее время повсеместно возрастает число лекарственно-устойчивых форм бактерий. Так, частота обнаружения пенициллинустойчивых ста­филококков доходит до 90-98%, стрептомицинустойчивых — 60-70% и выше, резистентность шигелл к ампициллину достигает 90% и более, к тетрациклину и стрептомицину — 54% и т.д. Устойчивость к анти­биотикам чаще возникает у бактерий, реже у спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм, дрожжеподобных грибов.

Механизмы резистентности микроорганизмов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам сложны и разнооб­разны. Главным образом они связаны со следующими причинами:

превращением активной формы антибиотика в неактивную форму путем ферментативной инактивации и модификации;

утратой проницаемости клеточной стенки для определенного химиотерапевтического препарата;

нарушениями в системе специфического транспорта данного препарата в бактериальную клетку;

возникновением у микроорганизмов альтернативного пути об­разования жизненно важного метаболита, заменяющего основной путь, блокированный препаратом.

Механизмы резистентности могут быть подразделены на первич­ные и приобретенные (схема 8.1).

К первичным механизмам относятся те, которые связаны с отсутствием «мишени» для действия данного препарата; к при­обретенным — изменением «мишени» в результате модифика­ций, мутаций, рекомбинаций. В первом случае речь идет о естествен­ной (видовой) резистентности, например у микоплазм к пенициллину из-за отсутствия у них клеточной стенки. Однако чаще всего резис­тентность к химиотерапевтическим препаратам, в том числе антиби­отикам, приобретается микробными клетками с генами резистентно­сти (г-гены), которые они получают в процессе свой жизнедеятельно­сти от других клеток данной или соседней популяции. При этом наиболее эффективно и с высокой частотой r-гены передаются плаз­мидами и транспозонами (см. 6.2). Один транспозон передает резис­тентность только к одному препарату. Плазмиды могут нести несколько транспозонов, контролирующих резистентность к разным химиоте­рапевтическим препаратам, в результате чего формируется множе­ственная резистентность бактерий к различным препаратам.

Устойчивость к антибиотикам бактерий, грибов и простейших также возникает в результате мутаций в хромосомных генах, контро­лирующих образование структурных и химических компонентов клет­ки, являющихся «мишенью» для действия препарата. Так, например, резистентность дрожжеподобных грибов рода Candida к нистатину и леворину может быть связана с мутационными изменениями цитоп­лазматической мембраны.

Таким образом, происходит образование отдельных резистентных □собей в бактериальной популяции. Их количество крайне незначи- кльно. Так, одна мутировавшая клетка (спонтанная мутация), устой­чивая к какому-либо химиотерапевтическому препарату, приходится ■в 10⁵—10⁹ интактных (чувствительных) клеток. Передача г-генов с плазмидами и транспозонами повышает число резистентных особей в популяции на несколько порядков. Однако общее число лекарствен­но-резистентных бактерий в популяции остается весьма низким.

Формирование лекарственно-устойчивых бактериальных популя­ций происходит путем селекции. При этом в качестве селективного фактора выступает только соответствующий химиотерапевтический препарат, селективное действие которого состоит в подавлении раз­множения огромного большинства чувствительных к нему бактерий.

Массовой селекции и распространению антибиотикорезистентных Г» териальных популяций способствуют многие факторы, например бесконтрольное и нерациональное применение антибиотиков для ле­чения и особенно для профилактики различных инфекционных забо­леваний без достаточных к тому оснований, а также использование пищевых продуктов (мясо домашних птиц и др.), содержащих анти- гпютики (тетрациклин).

Борьба с лекарственно-устойчивыми бактериями проводится разными путями. К ним относятся систематическое получение новых

3.2 Определение чувствительности бактерий к антибиотикам метолом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засе­вают газоном на питательный агар в чашке Петри, после чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие опре­деленные дозы разных антибиотиков (рис. 43). Посевы инку­бируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста культуры стафилококка судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста диаметром до 10 мм культура расценивается как малочувстви­тельная, а свыше 10 мм —как высокочувствительная. В том случае, если диски пропитаны разными концентрациями одного

и того же антибиотика, можно установить наименьшую дозу препарата, к которой чувствительна исследуемая бактериальная культура.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам метолом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (в мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буфер­ном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содер­жащей 10^е —10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37°С до следу­ющего дня, после чего отмечают результаты опыта по помут­нению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий содержащейся в ней минимальной ингибирующей дозой антибиотика (табл. 7).

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений в питательном агаре. Данный метод определения минимальной ингибирующей концентрации антибиотика более точен, чем предыдущий. Готовят двукратные разведения антибиотика, после чего к 1 ч. каждого разведения добавляют 9 ч. питательного агара, расплавленного и остужен­ного до 45° С. Смесь хорошо перемешивают в пробирке и выливают в чашку Петри. Приготовленные таким образом чашки, каждая из которых содержит определенную концен¬трацию антибиотика, делят на 20 секторов так же, как при фаготипировании стафилококка. На агаровую поверхность каждого сектора петлей засевают суточную бульонную куль¬туру исследуемой бактериальной культуры. Посевы инкубируют при оптимальной температуре до появления роста в контрольной чашке, не содержащей антибиотика, после чего учитывают результаты. Минимальная ингибирующая концентрация анти¬биотика определяется по видимой задержке роста бактерий по сравнению с контролем на чашке, содержащей наименьшее количество данного препарата.

химиотерапевтических препаратов, которые отличаются от сущестну ющих механизмом антибактериального действия. Перспективным направлением является химическая модификация известных антиби отиков с защищенными активными группами, устойчивыми к бакте риальным ферментам. Кроме того, проводятся исследования по изыс канию ингибиторов, подавляющих активность бактериальных фермен тов, а также препаратов, препятствующих адгезии (см. 10.1.1) бактерий на клетках макроорганизмов.

Особое значение приобретают мероприятия, рекомендованные ВОЗ для ограничения распространения лекарственно-устойчивых форм бактерий. Это прежде всего систематическое изучение типон лекарственной устойчивости патогенных и условно-патогенных бак¬терий, циркулирующих в пределах отдельных регионов.

Своевременная информация лечащих врачей о циркулирующих н данном регионе лекарственно-устойчивых бактериях помогает в вы боре наиболее подходящего по спектру действия препарата без прел варительного определения чувствительности выделенных бактерий Это позволяет избежать «слепого» использования большого числи антибиотических средств.

Рекомендуется также по мере возможности определять чувствк тельность выделенных бактерий к антибиотикам, а также ограничи вать их применение без достаточных показаний. Запрещается исполь зовать применяемые в медицине антибиотики в качестве консерван тов пищевых продуктов и кормовых добавок, для ускорения рост? профилактики и лечения различных заболеваний животных (сальмо¬неллезов и др.). В животноводстве рекомендуется применять такие антибиотики, которые не используются в медицинской практике. Боль шое значение имеет проведение эпидемиологического надзора за за ражением окружающей среды лекарственно-устойчивыми бактерия ми, которые передаются с пищевыми продуктами, сточными водами, больничными отходами. С этой целью необходимо систематически выявлять носительство антибиотико-устойчивых бактерий и прово дить другие профилактические мероприятия.

3.3. Минимальная бактерицидная концентрация, МБК (minimum bactericidal concentration, MBC) [лат. minimus — наименьший; греч. bakterion — палочка и лат. caedo — убиваю; лат.concentratio — центр, сосредоточение] — минимальная концентрация дезинфектанта (антибиотика), выраженная в мг / л или мкг / мл, которая вызывает полную гибель стандартных тест-штаммов бактерий (см. Тест-штамм) в суспензии или на поверхности носителей за короткий срок (0,5—15 мин).