18 А фракции рнк, %

общей РНК

I

II III

154 112 70

2,1875 2,0492 1,8451

31 17 15

33,91 17,42 13,84

65,17

52,03 26,73 21,24

100

рРНК рРНК тРНК

Всего

Задания. 1. Провести фракционирование тотальной РНК методом электрофореза в ПААГ. 2. Рассчитать содержание каждой фракции РНК (%).

Занятие № 5 определение константы седиментации рнк методом электрофореза в полиакриламидном геле

В результате широкого применения электрофореза в ПААГ для фракционирования белков и нуклеиновых кислот установлено, что электрофоретическая подвижность биополимеров обратно пропорциональна константе седиментации, а следовательно, и относительной молекулярной массе. Если в исследуемом образце имеется компонент с известной относительной молекулярной массой (или константой седиментации), то можно рассчитать значения указанных величин для других компонентов. В качестве образцов РНК с известной константой седиментации используют р ибосомальные РНК, выделенные из кишечной палочки Е. соН (соответственно 238 и 168) или из печени крысы (соответственно 288 и 188).

Цель занятия. Научиться определять константу седиментации (или относительной молекулярной массы) РНК методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Ход работы. На три колонки с ПААГ наносят 0,01—0,05 мл раствора, содержащего 30—60 мкг РНК, выделенной из анализируе- мой ткани животного или клеток бактерий, на две другие — столько же РНК из печени крысы и РНК из Е. соН. Колонки помещают в общий электрофоретический блок и проводят электрофо- рез. Условия проведения электрофореза и обработки колонок с полиакриламидным гелем аналогичны тем, что указаны в заня- тии № 4.

Задания. Определить относительную электрофоретическую подвижность каждой фракции РНК по отношению к краске-лиде- ру. 2. На основании полученных данных построить график зави- симости электрофоретической подвижности от константы седи- ментации для фракции РНК печени крысы и Е. соН. Для этого по оси ординат отложить величины константы седиментации (288 и188, 238 и 168) или значения относительной молекулярной массы РНК, по оси абсцисс — их относительную электрофоретическую подвижность. 3. По величине электрофоретической подвижности высокомолекулярных фракций РНК анализируемой ткани опре- делить константы седиментации этих фракций или значения от- носительных молекулярных масс.

Практическая работа № 4 выделение нуклеиновых кислот с использованием сорбентов

В настоящее время наряду с классическими (см. практическую работу № 3) широкое применение нашли методы выделения нуклеиновых кислот, использующие принцип их сорбции—десорбции в процессе выделения и очистки. ДНК или РНК, полученные в результате клеточного лизиса, связываются с сорбентом и в таком состоянии проходят все стадии очистки, а затем в результате элюции переходят в раствор. В качестве сорбента широко применяют частицы SiO₂, в ряде случаев связанные с железом.

В настоящее время производится целый ряд коммерческих наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот методом сорб-ции. Использование таких наборов обеспечивает минимальные потери и высокое качество выделенной нуклеиновой кислоты при минимальных затратах времени. Использование наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот на сорбентах позволяет исключить из процесса вредные для здоровья человека вещества (все компоненты наборов в применяемых концентрациях нетоксичны) и стандартизировать выход ДНК.

Наборы реагентов БхаЮт™ БМА Ргер 100 и В1а1от™ 1ША Ргер 100 (ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ») позволяют очистить ДНК и РНК соответственно после сорбции нуклеиновых кислот на суспендированных частицах SiO ₂ (NucleoS™-сорбент) из лизата клеток, полученного при использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом. Этот реагент предназначен для лизиса клеток, солюбилизации (растворения) клеточного дебриса и денатурации клеточных нуклеаз.В присутствии лизирующего реагента ДНК и РНК активно сорбируются на NucleoS™-сорбенте. Последующая очистка нуклеиновых кислот, связанных с сорбентом,от возможных сопутствующих примесей производится спиртовым раствором ацетата калия (рабочий раствор солевого буфера), и, наконец, отделение фрагментов ДНК и РНК от частиц сорбента (растворение, элюция) наиболее полно обеспечивается суспензи- ей ионообменных смол (ЭкстраГенЕ™). Для растворения нуклеиновых кислот на этом этапе можно использовать стерильную деионизованную воду или буфер ТЕ, однако потери ДНК при элю- ции возрастут на 15—20 %.

Цель работы. Освоить методы выделения нуклеиновых кислот с использованием сорбентов.

Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок до 65 °С. 2. Микроцентрифуга высоскоростная до 10 000 #. 3. Микроцентрифуга-вортекс для микропробирок. 4. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 5. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 6. Цилиндр мерный вместимостью 200—500 мл. 7. Пестик-гомогенизатор для микропробирок вместимостью 1,5 мл. 8. Перчатки латексные неопудренные. 9. 96%-ный этанол. 10. Вода дистиллированная. 11. Образец свежей животной или растительной ткани для выделения ДНК и РНК. 12. Набор реагентов Diatom™ DNA Ргер 100, включающий: Lysis reagent! (лизирующий реагент), Saline buffer (10х солевой буфер), NucleoS^TM (суспензия сорбента), Extra Gene Е™ (ЭкстраГен Е™, суспензия смеси ионообменников). 13. Набор реагентов Diatom™ RNA Ргер 100, включающий:RNA Lysis Reagent (лизирующий реагент), ЕxtraGeneЕ™ (ЭкстраГен Е™), суспензия смеси ионообменников, NucleoS™ (суспензия сорбента для РНК), Saline buffer (5х соле- вой буфер).