Занятие № 4 фракционирование и определение соотношений _. Рибосомальных и транспортных рнк методом электрофореза в полиакриламидном геле
Для фракционирования тотальной РНК используют методы ультрацентрифутирования в градиенте плотности сахарозы, коло- ночную хроматографию и электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).
Особого внимания из перечисленных методов заслуживает метод электрофореза в ПААГ. Преимущество этого метода состоит в том, что можно контролировать величину пор синтетического геля и одновременно проводить анализ большого количества образцов. Для фракционирования РНК используют гель с низкой концентрацией акрил амид а (1,8—3,5 %). Электрофорез в ПААГ с концентрацией акриламида 2,4 % позволяет разделить суммарную РНК на три фракции: две высокомолекулярные и одну низкомолекулярную. Наиболее прост в исполнении диск-электрофорез РНК на колонках ПААГ.
Цель занятия. Научиться фракционировать РНК и определять содержание различных РНК.
Оборудование и материалы. 1. Спектрофотометр. 2. Микрофотометр. 3. Источник питания для электрофореза. 4. Прибор для вертикального электрофореза. 5. Термостат (водяная баня). 6. Шприц стеклянный вместимостью 50 мл. 7. Трубки стеклянные с внутренним диаметром 0,5—0,6 см. 8. Колбы мерные вместимостью 100 и 1000 мл. 9. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 10. Препарат РНК, выделенный по методу Шеррера. П. Цианогум-41 (или акриламид и Ы,Н'-метилен-&мс-акриламид). 12. Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД). 13. 10%-ный раствор персульфата аммония. 14. 40%-ный раствор сахарозы. 15. 0,25%-ный раствор бромфенолового синего. 16. трмс-ацетатный буфер рН 7,8 (0,12 М трис, 0,06 М ацетат натрия, 0,003 М ЭДТА-№, рН довести до 7,8 ледяной уксусной кислотой, для чего потребуется около 6 мл этого реактива). 17. 0,5 М хлорная кислота. 18. 1 М уксусная кислота. 19. 0,2%-ный раствор метиленового синего в 0,4 М ацетатном буфере.
Ход работы. Приготовление геля. Для этой цели используют цианогум-41, представляющий собой смесь 95%-ного акриламида и 5%-ного М,М'-метилен-6мс-акриламида. Фракционирование суммарной РНК, выделенной по методу Шеррера, проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле с конентрацией акриламида 2,4 %. К 2,53 г цианогума-41 (или к 2,4 г акриламида и 0,13 г 14,№-метилен-6ш-акриламида) добавляют 33,3 мл т/> исацетатного буфера (рН 7,8), 50 мл дистиллированной воды и 0,08 мл ТЕМЭД. Смесь тщательно перемешивают, добавляют 0,8 мл 10%-ного раствора персульфата аммония, доливают воду до метки (100 мл), еще раз хорошо перемешивают и заполняют этим раствором стеклянные трубки для электрофореза с внутренним диаметром 0,5—0,6 см и длиной 7—8 см. Процесс полимеризации проводят без доступа кислорода, для чего после добавления в колонку полимеризуемой смеси наслаивают на нее буферный раствор. Перед заполнением электрофоретической камеры трис-ацетатный буферный раствор (рН 7,8) разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:2.
Нанесение образца РНК на гель. После полной полимеризации геля на его поверхность наслаивают 0,01—0,05 мл раствора, содержащего 30—60 мкг РНК, 40%-ный раствор сахаро зы (конечная концентрация 20 %) и 0,01 мл 25%-ного водного раствора бромфенолового синего. Сахароза повышает плотность раствора РНК, вносимого в колонку, по отношению к плотности буфера, и обеспечивает надежный контакт испытуемого образца с поверхностью геля.
Концентрацию РНК в испытуемой смеси определяют следующим образом: к 0,1мл раствора, содержащего РНК, добавляют 5 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты и проводят гидролиз на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем измеряют оптическую плотность гидролизата на спектрофотометре при 270 и 290 нм. Концентрацию РНК, мкг/мл, определяют по формуле
(А270 - А290) ■ \0,5
'мкг/мл 0,19
где А — оптическая плотность при соответствующей длине волны;
10,5 — коэфициент пересчета, выведенный на основании теоретического расчета содержания фосфора в РНК; 0,19 - коэффициент, соответствующий содержанию 1 мкг РНК в 1 л раствора, полученный при замере на спектрофотометре содержания фосфора нуклеиновых кислот указанной концентрации.
Проведение электрофореза и обнаружение РНК Электрофорез проводят при силе тока 5 мА на колонку и температуре 0—3 °С в течение 60 мин. После его окончания гели извлекают из трубок, фиксируют и окрашивают. Фиксацию проводят 1 М раствором уксусной кислоты в течение 15 мин, а окрашивание — 0,2%-ным раствором метиленового синего в 0,4 М ацетатном буфере (рН 4,7) в течение 4 ч. Краситель с той части колонки, которая не содержала нуклеиновых кислот, многократно отмывают водой в течение 8—12 ч. Полученные электрофореграммы фотографируют и денситометрируют (рис. 3). Площадь пика, соответствующую каждой фракции РНК, рассчитывают по формуле
где А — содержание фракции РНК, условные единицы; \% к — десятичный логарифм высоты пика; а — основание пика, мм.
Суммируя величины А, полученные для всех фракций, находят общее содержание РНК в условных единицах и рассчитывают далее процентное содержание каждой фракции РНК. Зная количество РНК в образце, нанесенном на колонку, вычисляют содержание каждой фракции РНК (табл. 4).
Номер
фракции
Вид РНК