Занятие № 3 выделение тотальной рнк по шерреру

Этот классический метод применяют для выделения тотальной РНК из любых животных тканей, а также из клеток бактерий, например кишечной палочки (Еscherichia coli). Принцип метода заключается в том, что при обработке ткани водонасыщенным фенолом, содержащим 0,5%-ный раствор додецилсульфата натрия, в водную фазу при 4 °С переходят и ДНК, и РНК. Однако при нагревании до 50—60 "С ДНК остается в связанном состоянии и в водную фазу переходит только РНК.

Цель занятия. Ознакомиться с классическим методом выделения тотальной РНК по Шерреру.

Оборудование и материалы. 1. Центрифуга рефрижераторная до 4500 #. 2. Гомогенизатор. 3. Термостат (водяная баня).4.Шприц стеклянный вместимостью 50 мл. 5. Воронка Бюхнера диаметром 65 мм. 6. Ступка фарфоровая. 7. Колба коническая вместимостью 200 мл. 8. 2%-ный раствор ИаОН. 9. 0,2%-ный раствор додецилсульфата натрия. 10. 96%-ный этанол. 11. 0,5 н. хлорная кислота. 12. Фенол свежеперегнанный водонасыщенный. 13. Поливинилсульфат. 14. 0,01 М ацетатный буфер рН 5,2 (смешивают 10,5 мл 0,02 М раствора уксусной кислоты и 39,5 мл 0,02 М раствора ацетата натрия и доводят объем водой до 100 мл). 15. Хлорид магния. 16. Реактив для растворения РНК: 0,05 М N301, 0,01 М ацетат натрия, 0,0001 М МёС1₂. 17. Жидкий азот. 18. Лед. 19. Свежая ткань животного.

Ход работы. 1. Ткань животного предварительно промывают для инактивации поверхностных нуклеаз сначала 2%-ным водным раствором гидроксида натрия, затем 0,2%-ным раствором ДДСЖа и, наконец, дистиллированной водой. Эту операцию проводят на воронке Бюхнера; на 1 г ткани берут по 50 мл указанных растворов.

2. В фарфоровую ступку помещают 1 г промытой ткани, измельчают с жидким азотом в тонкий порошок, после чего растирают в ступке с 10 мл 0,01 М ацетатного буфера (рН 5,2), содержащего 0,001 М М§С1₂, 0,5%-ный ДДС-Ма и 2 мкг/мл поливинилсульфата (ингибитор активных РНКаз), в течение 30 мин при повторном замораживании и оттаивании. Если нет жидкого азота, то ткань предварительно измельчают в гомогенизаторе, затем переносят в фарфоровую ступку, охлажденную льдом, и проводят растирание, как описано выше.

3. Полученную вязкую суспензию переносят в стакан, прибавляют 10 мл свежеперегнанного водонасыщенного горячего фенол(60 °С) и взбалтывают в течение 3 мин на водяной бане при 60 "С.

4. Смесь охлаждают во льду и центрифугируют при 4500 # и температуре 4 °С в течение 30 мин. В результате центрифугирования образуется три слоя: верхний водный, промежуточный, нижний фенольный.

5. Водный слой осторожно отсасывают шприцем в колбу и дважды обрабатывают водонасыщенным фенолом, предварительно Нагретым до 60 "С, проводя каждый раз быстрое охлаждение и центрифугирование при 4500 # и температуре 4 "С в течение 30 мин. После каждого центрифугирования водный слой отбирают и обрабатывают далее, а фенольный отбрасывают.

Для осаждения РНК к водному слою добавляют два объема96%-ного этанола. Осадок РНК формируется в течение нескольких часов при 0 °С.

7. Осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 4500 § и температуре 0 °С, спирт отбирают, а осадок РНК растворяют в 5 мл 0,05 М раствора хлорида натрия, содержащего 0,01 М ацетата натрия и 0,0001 М хлорида магния. Из полученного раствора РНК снова осаждают двумя объемами 96%-ного этанола. Осадок РНК выпадает за 1,5—2 ч при температуре —10 "С.

8. Осадок РНК либо хранят под спиртом, либо отделяют центрифугированием, спирт отбрасывают, а осадок снова растворяют в 5 мл раствора, содержащего хлорид натрия, ацетат натрия и хлорид магния, и хранят в холодильнике без замораживания.

Контрольные вопросы. 1. Какой принцип лежит в основе метода выделения тотальной РНК по Шерреру? 2. Что обеспечивает инактивацию РНКаз и сохран- ность РНК при выделении ее данным методом?

Задание. Получить препарат тотальной РНК из ткани живот- ного.