Занятие № 2 став-экстракция днк из растений

Цель занятия. Освоить классический метод выделения и очистки ДНК из растительных объектов с помощью СТАВ.

Оборудование и материалы. 1. Термостат (водяная баня). 2. Центрифуга до 5000 § для пробирок вместимостью до 15 мл. 3. Микроцентрифуга до 10 000 # для микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 4. Термостат твердотельный для микро-пробирок вместимостью до 1,5 мл. 5. Фарфоровые ступки с пестиками. 6. Весы лабораторные на 0,01—10 г. 7. Пробирки центрифужные вместимостью 15 мл с завинчивающейся крышкой. 8. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 9. Образец свежих растительных тканей (листья, молодые побеги, кожура плодов). 10. Жидкий азот в сосуде Дьюара. 11. 1 М трис-НС1 буферный раствор рН 8*. 12.5 М раствор №С1*. 13. 0,5 М раствор ЭДТА-№ рН 8*. 14. р-меркаптоэтанол*.15.СТАВ(смесь изомеров алкилтриметиламмоний бромида). 16. ТЕ-буфер (10 мМ трис- НС1, 1 мМ ЭДТА-№ рН 8)*. 17. Деионизованная вода. 18. Смесь хлороформ + + изоамиловый спирт (24: 1), насыщенная ТЕ-буфером, рН 8**. 19. Фенол пере- гнанный, насыщенный ТЕ-буфером рН 8**. 20. Раствор РНКазыА (10 мг/мл, готовить на стерильной деионизованной воде, после растворения препарата РНКазыА раствор выдержать 15 мин на кипящей водяной бане для инактивации ДНКаз)*. 21. Изопропанол. 22. 3 М раствор ацетата натрия. 23. 96%-ный этанол. 24. 70%-ный этанол.

- * Хранить при температуре 2—8 °С.

** Хранить в темноте и при температуре 2—8 "С.

Ход работы. Приготовление экстрагирующего буфера (СТАВ-б у ф е р).

Внимание! Использовать только свежеприготовленный раствор.

Смешивают отдельные компоненты СТАВ-буфера в герметично закрывающейся посуде (например, пластиковом флаконе с завинчивающейся крышкой) в соответствии с требуемым объемом конечного раствора, исходя из указанных пропорций (можно рас- считать самостоятельно) (табл. 3).

3. Состав и	приготовление		СТАВ-буфера
Компонент		Конечный объем раствора, мл
		10	20 30 50	80

Деионизованная вода, мл	7,3	14,6	21,9	36,5	58,4
1 М трис-ЯС\ рН 8, мл	1,0	2,0	3,0	5,0	8,0
5 М №С1, мл	1,4	2,8	4,2	7,0	11,2
0,5 М ЭДТА-№ рН 8, мл	0,20	0,40	0,60	1,0	1,6
Р-Меркаптоэтанол, мл	0,10	0,20	0,30	0,50	0,8
СТАВ, г	0,10	0,20	0,30	0,50	0,80

Раствор перемешивают, нагревают смесь до 65 "С на водяной бане до полного растворения СТАВ, используют готовый раствор в течение 1 ч (до употребления не давать раствору остыть!).

Выделение ДНК. 1. Помещают в фарфоровую ступку 2 г свежей растительной ткани (лучше листья), заливают жидким азотом и очень быстро растирают (не допуская оттаивания) до состояния мелкого порошка.

2. Полностью переносят порошок в центрифужную пробирку вместимостью до 15 мл, добавляют 9 мл свежеприготовленного и нагретого до 65 °С СТАВ-буфера, пробирку закрывают, содержимое перемешивают, несколько раз перевернув пробирку.

3. Пробирку инкубируют 60 мин при 65 °С на водяной бане, каждые 10—15 мин содержимое перемешивают, несколько раз перевернув пробирку.

2. Охлаждают пробирку 4—5 мин при комнатной температуре.

3. К гомогенату добавляют 4,5 мл смеси хлороформ + изоамиловый спирт, пробирку закрывают, содержимое перемешивают,несколько раз перевернув пробирку, до образования стойкой белесой взвеси.

4. Пробирку ценрифугируют 20 мин при 5000 # (скорость вращения рассчитывают в соответствии с диаметром ротора).

5. Верхнюю водную фазу полностью отбирают в чистую центрифужную пробирку вместимостью до 15 мл.

6. Добавляют в пробирку 10 мкл раствора РНКазы А, инкубируют 40 мин при 37 "С.

9. По окончании инкубации в пробирку добавляют 6 мл изопропанола (предварительно охлажденного до —18 °С), содержимое очень аккуратно перемешивают, плавно переворачивая закрытую пробирку несколько раз до полного объединения фаз. В процессе перемешивания должен появиться заметный осадок ДНК в виде рыхлого комка — «медузы». Если этого не происходит, оставляют пробирку при -18 "С на 1—3 ч, можно на ночь (16—18 ч), но не более.

10. Осадок ДНК извлекают из пробирки, намотав его на стеклянный капилляр, и переносят в чистую микропробирку вместимостью 1,5 мл. Если намотать осадок на капилляр не удается, центрифугируют его 1 мин при 5000 §, супернатант полностью удаляют.

11. Осадок ДНК сушат на воздухе 7—10 мин, как можно более полно удалив перед этим с осадка всю жидкость.

12. Добавляют к осадку 500 мкл стерильной деионизованной воды и оставляют растворяться в течение ночи при температуре

2-8⁰С

Очистка ДНК фенолом и хлороформом. 1. К раствору ДНК добавляют 500 мкл фенола, насыщенного ТЕ-буфером (для этого раствор ДНК предварительно переносят в микро-пробирку вместимостью 1,5 мл, если это не сделано ранее). Про-бирку несколько раз переворачивают до образования стойкой взвеси, а затем выдерживают в таком состоянии еще 1 мин.

2. Микропробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #, супернатант полностью переносят в чистую микропробирку, не задевая нижней фенольной фазы и твердой интерфазы.

3. Добавляют к раствору 250 мкл фенола и 250 мкл смеси хлороформ + изоамиловый спирт. Пробирку несколько раз переворачивают до образования стойкой взвеси, а затем выдерживают в таком состоянии еще 1 мин.

2. Микропробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #, супернатант полностью переносят в чистую микропробирку, не задевая нижней фенольной фазы и твердой интерфазы.

5. Добавляют к раствору 500 мкл смеси хлороформ + изоамиловый спирт. Пробирку несколько раз переворачивают до образования стойкой взвеси, а затем выдерживают в таком состоянии еще 1 мин.

6. Микропробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #, супернатант полностью переносят в чистую микропробирку, не задевая нижней фенольной фазы и твердой интерфазы.

7. Добавляют в пробирку 50 мкл 3 М раствора ацетата натрия,аккуратно перемешивают и сразу добавляют 1 мл 96%-ного этанола. Аккуратно перемешивают содержимое, плавно переворачивая пробирку несколько раз до полного объединения фаз. В процессе перемешивания должна появиться «медуза». Если этого не происходит, оставляют пробирку при -18 °С на 1—3 ч, можно на ночь,но не более.

8. Микропробирку центрифугируют при 10 000 § в течение 1—3 мин, в зависимости от компактности «медузы» (чем она плотнее, тем меньше).

9. Супернатант полностью удаляют, осадок промывают, ополоснув небольшим количеством (100 мкл) сначала 70%-ного, а затем дважды 96%-ного этанола.

10. Сушат осадок в открытых пробирках при 56 °С в течение 5—7 мин.

11. Добавляют к осадку 300 мкл ТЕ-буфера и оставляют растворяться в течение ночи при температуре 2—8 "С.

Хранить полученный раствор ДНК лучше при -18 "С, не допуская частого размораживания, или в противном случае при 2—8 "С.

Контрольные вопросы. 1. Чем отличаются процессы экстракции ДНК из расти- тельных и животных тканей? 2. Почему для экстракции растительной ДНК требу- ется осаждение (а иногда и многократное осаждение) из раствора? В чем смысл этой процедуры? 3. Почему недопустимо многократное размораживание водного раствора ДНК в ходе хранения?

Задания. 1. Получить препарат растительной ДНК. 2. Составить описание выделения ДНК из 100 мг растительной ткани для аналитических целей (например, ПЦР).