Практическая работе № 3 выделение и фракционирование наулеиновых кислот эукариот классическими методами

Выделение (экстракция) нуклеиновых кислот эукариот сопряжено с определенными трудностями, связанными с особенностями молекулярной структуры ДНК и РНК, их функциями и внутриклеточной локализацией.

Для выделения геномной ДНК эукариот необходимо: 1 — разрушить клеточные стенки; 2 — разрушить клеточную и ядерную мембраны; 3 — отделить ДНК от белков; 4 — очистить ДНКот примесей низкомолекулярных веществ.

Разрушение клеточных стенок. Основным компонентом клеточных стенок животных и растений являются полисахариды, а эти макромолекулы не только механически мешают очистке ДНК, но и обладают химическим сродством к нуклеиновым кислотам. Полисахаридная оболочка клеток весьма прочная, особенно у растений, так как она в основном состоит из целлюлозы — химически и механически стойкого полимера. Кроме полисахаридов, преимущественно у растений, в составе как клеточной стенки, так и вакуолей имеются легко полимеризующиеся (в данном случае осмоляющиеся) в присутствии окислителей (в частности, кислорода воз- духа) соединения, такие как смоляные кислоты, фенолы, танины. Особенно высокого уровня содержание таких соединений достигает в коре ряда древесных (хвойные,косточковые) и у некоторых травянистых видов растений, поэтому выделение ДНК в этих случаях наиболее затруднительно и требует присутствия химических антиоксидантов.

У животных клеточная стенка не обладает столь жесткой структурой и химически менее агрессивна,однако для экстракции ДНК и здесь имеется ряд ограничений. В частности, следует избегать использования тканей, богатых липидами, так как экстракт ДНК — водный раствор, поэтому липиды (жиры) будут мешать ее растворению. Следует избегать экстракции ДНК из ногтей, когтей, волос и половых клеток (особенно икринок и яиц), в которых удельное содержание ДНК очень низкое. Кроме того, на покровах тела животных и на наружных тканях растений весьма высока вероятность присутствия посторонней ДНК, принадлежащей, например, микроорганизмам, водорослям, грибам, мелким животным или их сообществам, постоянно обитающим или случайно попавшим на данный организм. Поэтому для выделения ДНК следует использовать только специально обработанные стерильные ткани или ткани, извлеченные из основной массы экспериментального материала с помощью стерильных инструментов. Иногда в подобных случаях можно захватить чужеродную ДНК эндопаразитов. Если имеются основания для подобных подозрений, фрагменты используемых для экстракции ДНК тканей следует подвергнуть микроскопированию, чтобы убедиться в отсутствии в них эндопа-азитов.

Для разрушения клеточных стенок при выделении ДНК используют преимущественно ионные детергенты, такие как додецилсульфат натрия (ИДС-Иа) и смесь изомеров алкилтриметиламмоний бромида (СТАВ).

Разрушение клеточной и ядерной мембран.

Внутри клеток геномная ДНК целиком сосредоточена в ядре, клеточная и ядерная мембраны полностью деградируют после обработки суспензии клеток детергентом. Именно по этой причине детергент или композиция из нескольких детергентов—обязательный компонент любого раствора для экстракции ДНК.

Отделение ДНК от белков. ДНК представлена в клетке комплексом с белками, связанными с нуклеиновой кислотой как слабыми водородными, так и сильными электростатическими и ковалентными связями. Кроме того, белки как высокомолекулярные природные полимеры при выделении ДНК часто механически «сплетаются» с ней. Некоторые белки-ферменты могут расщеплять ДНК, и при их совместной с ДНКэкстракции может произойти химическая (ферментативная) деградациянуклеиновой кислоты. Поэтому получить препарат геномной ДНК совершенно без примеси белков и повреждений практически не удается, тем более что большинство способов очистки от белка основаны на их денатурации фенолом, что может нарушить целостность первичной структуры самой нуклеиновойкислоты. Для обезжиривания препаратов и освобождения их от фенола используютхлороформ. Очистка ДНК от примесей низкомолекулярных веществ. Выделить ДНК из животных тканей значительно проще, чем из растительных, так как ее удельное содержание в животных клетках (0,25 % массы клетки, например, у млекопитающих) в среднем выше, чем в растительных (0,01—0,1 %). Кроме того, в вакуолях растительных клеток могут накапливаться химически активные вещества, способные взаимодействовать во внеклеточной среде с образованием разнообразных продуктов (отличных от уже упоминавшихся смол). Такие вещества, как гликоалкалоиды, танины, фенолы, ряд катионов тяжелых металлов способны ингибировать широко распространенные в практике молекулярной биологии,но весьма «прихотливые» к составу реакционной среды ферменты (рестриктазы, лигазы, ДНК-полимеразы). В таком случае использование экстрагированной ДНК становится невозможным. Поэтому очистка ДНК от низкомолекулярных соединений,которую производят путем переосаждения (перекристаллизации) нуклеиновой кислоты спиртом, является обязательным этапом или несколькими этапами) выделения ДНК из растительных тканей.

Методы выделения ДНК условно делят на аналитические и препаративные, что зависит от количества требуемой ДНК. Эти методы различаются величиной навесок исходногоматериала,объемами растворов реагентов. В данном руководстве экстракцию ДНК из растительных тканей предлагается проводить препаративным методом (хотя представленную методику можно успешно применять и в аналитических целях), а из животных — препаративно-аналитическим. Главное условие — строгое соблюдение исходно установленных соотношений навесок и объемов реагентов.

Препарат выделенной ДНК (учитывая вероятное присутствие з нем ферментов, способных разрушать нуклеиновые кислоты, а также особенности молекулярной структур ДНК) рекомендуется хранить в замороженном состоянии. Причем замораживание препарата следует проводить при температуре —56 "С и ниже, чтобы он не сопровождался кристаллизацией и льдообразованием, что может стать причиной разрывов нитевидных молекул ДНК. Для таких целей можно использовать специальные низкотемпературные морозильные камеры — криогенераторы, криостаты или кельвинаторы. Препарат ДНК можно хранить и в бытовой морозильной камере (-18 °С) при условии, что размораживание будет проводиться нечасто. Другой способ — хранение ДНК в виде осадка в неводной среде, чаще всего под 70%-ным этанолом. Спиртовой осадок ДНК компактен и практически не подвержен механическому и ферментативному разрушениям, так как подавляющее большинство ферментов неактивно в спиртовом растворе.