Практическая работа № 16 осаждение белков сульфатом аммония

Метод осаждения белков хорошо растворимыми солями органических и минеральных кислот—высаливание—практикуют уже более 130 лет. Суть его состоит в том, что среди молекул растворенных веществ существует определенная конкуренция за молекулы растворителя, которые необходимы для солюбилизации, т. е. собственно процесса растворения. Растворенные вещества, имеющие большую плотность заряда (т. е. малый размер и высокий заряд), прочно связывают молекулы растворителя, а в случае дефицита отнимают их у других веществ. В частности, хорошо растворимыми веществами с высокой плотностью заряда и связанной с этим способностью к солюбилизации (гидратации, если растворитель вода) являются соли. Белки имеют небольшую плотность заряда (огромная молекула, имеющая небольшой заряд, обусловленный способностью к ионизации только у пяти из более чем 20 аминокислотных остатков). При достижении определенной концентрации хорошо растворимая соль вытесняет из раствора белки, которые выпадают в осадок (преципитируют).

Индивидуальные белки различаются размером молекулы и долей несущих заряд радикалов в аминокислотныхостатках (арг, лиз, гис — положительный заряд; глу и асн — отрицательный за-ряд), поэтому они имеют неодинаковую плотность заряда и высаливаются при разной концентрации соли. При плавном повышении концентрации соли первыми высаливаются хуже растворимые белки, как правило, высокомолекулярные (глобулины), затем — средние по размеру (заряду) молекулы и, наконец, наилучшим образом растворимые низкомолекулярные белки (альбумины). Таким образом, при высаливании белков появляется возможность их фракционирования, по крайней мере, частичного, предваряющего более эффективные методы разделения белковых молекул. Возможна также и очистка определенной белковой фракции от сопутствующих белков путем их ступенчатой преципитации: сначала удаляют те, которые растворяются хуже целевого белка, а затем осаждают целевой белок, тогда как другие, хорошо растворимые, белки остаются в растворе. В этом случае оптимальную концентрацию сульфата аммония определяют эмпирически путем титрования гомогенного препарата того же белка в тех же условиях (суммарная концентрация белка, рН и температура раствора).

При равной молярной концентрации поливалентные анионы более эффективны для высаливания, чем моновалентные (отчасти из-за того, что имеет значение не концентрация соли, а ионная сила раствора), а поливалентные катионы даже препятствуют действию поливалентных анионов. Получается, что оптимальное сочетание — это поливалентный анион с моновалентными катиона-ми. Эффективность высаливания убывает в ряду Гофмейстера (Hofmeister): цитрат > сульфат > фосфат > хлорид > нитрат > тиоционат.

В этом же ряду убывает стабилизирующий эффект и возрастают хаотропные свойства соли. Таким образом, наиболее подходящими кандидатами являются цитрат исульфат.Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости (например, при нормальной температуре растворимость аммонийных солей цитрата и сульфата равна примерно 2,5 и 4,1 М), низкой цены и стабилизирующего влияния, которое он оказывает на большинство белков при концентрациях выше 0,5 М.

Механизмы преципитации белков сульфатом аммония. Заключа- ются в следующем:

1) молекула белка становится более компактной и менее растворимой за счет взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более эффективно при рН < р12) происходит обезвоживание белка. Один ион 5 О², непосредственно гидратирует 13—15 молекул,т.е. 3 Мсульфатаммониясвязывает примерно 45 из имеющихся в воде 55 молекул.

Факторы, влияющие на растворимость белков. Ионная сила и температура р а с т в о р а. Ионная сила — параметр раство- ра, характеризующий суммарную концентрацию и заряд всех вхо- дящих в его состав ионов. Ее определяют по формуле

I=½∑( c_i z_i²)

где c_i- — концентрация иона, z_i, — заряд иона.

Например, для 1М NaС1 I=½[1(1)²+1(1)²]=1, для 1М (NH₄)₂SO₄ I=½[1(1)²+1(1)²]=3 При низкой ионной силе (<0,2 М) растворимость белка увеличивается при повышении концентрации соли, так как экранирование притяжения противоположно заряженных групп приводит к разрыхлению структуры белка. При высокой ионной силе (>0,2М) растворимость белка понижается из-за обезвоживания. Она падает экспоненциально с повышением ионной силы:

где S — растворимость белка, г/л; β и Кs, — константы; I — ионная сила (рис. 20).

К_s,несколько различается для разных белков и почти не зависит от рН и температуры, β сильно зависит от белка, рН и температуры: повышение температуры вызывает понижение р и соответственно уменьшение растворимости белка.

рНи температура раствора. При низкой ионной силе (<0,2М)растворимость белка минимальна при рН, равном изоэлектрической точке. При высоких концентрациях (NН₄)₂5О₄ растворимость повышается с повышением рН, так как при низких рН сульфат-ион взаимодействует с положительно заряженными группами и«уплотняет» молекулу белка. Поэтому лучше проводить осаждение при рН<р1.

Начальная концентрация белка. Начальная концентрация белка в растворе в ряде случаев оказывает оп-ределенное влияние на растворимость белков. Это касается индивидуальных особенностей белков и устанавливается эмпирически, для большинства же белков, если речь не идет о пересы-щенных растворах, растворимость белка не зависит от начальной концентрации. Однако нужно всегда иметь в виду, что из-за больших размеров молекул белков и малого суммарного заряда, а также высокого сродства молекул белка друг к другу истинный раствор белка можно получить, только выдержав его после приготовления несколько часов (чаще раствор выдерживают в течение ночи, иногда для формирования раствора белка требуется несколько дней).

Ограничения метода. Высокая концентрация ионов аммония в осадке может мешать точному определению концентрации белка:

высаливаются не только белки, но, например, и детергенты. Например, 0,5%-ный раствор Тween 20 и Тriton X—100 начинают агрегировать при концентрациях сульфата аммония больше 1М. Образующийся преципитат имеет плотность чуть меньше плотно- сти солевого раствора. При центрифугировании он всплывает, захватывая белки;

осаждение сульфатом аммония нельзя использовать для белков, требующих присутствия Са²⁺, из-за нерастворимости сульфата кальция.

Высаливание сульфатом аммония — очень удобный и доступный прием концентрирования и сохранения нативных препаратов белков. Этот метод особенно удобен для биологических жидкостей (кровь, лимфа, моча и др.). В частности, одним из самых доступных для практических работ объектов такого рода является гемолимфа насекомых. Сбор гемолимфы осуществляют путем надрезания ложноножек гусениц различных распространенных в природе видов насекомых. Гемолимфу собирают в любые подходящие стеклянные или пластиковые сосуды (пробирки, склянкии т. д.), добавляют в нее несколько кристаллов фенилтиомочевины (для ингибирования высокоактивной тирозиназы), измеряют объем и добавляют сухой сульфат аммония до степени насыщения 0,9. Выпавший осадок белков может храниться в герметично закрытых емкостях при температуре 2—8 ⁰C в течение нескольких лет без значительного изменения свойств белков (включая сохранение каталитической активности целого ряда ферментов). Учитывая очень высокую концентрацию белков в гемолимфе насекомых (10 % и более), этот материал чрезвычайно удобен для использования в ходе практических работ.

Цель работы. Ознакомиться с методом фракционирования белков сульфатом аммония.

Оборудование и материалы. 1.Микроцентрифуга высокоскоростная (до 10 000 g) с функцией охлаждения. 2. Термостат твердотельный с функцией охлаж дения для микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 3. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 4. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 5. 4,5 М раствор сульфата аммония (59,45 г растворить в 100 мл воды), охлажденный до 2—8 °С. 6. Анализируемый раствор белков. Можно использовать экстракт белков, полученный из животных тканей (см. практическую работу № 15) или раствор белка яйца в воде (1 : 5). 7. Вода стерильная деионизованная.

Ход работы. 1. Отобрать 350 мкл анализируемого раствора белков в микропробирку, охладить пробу в термостате до 4 °С.

2. Осторожно при непрерывном помешивании прибавить необходимый объем 4,5 М раствора сульфата аммония (данные содержатся в таблице 9) и 2—3 раза плавно пипетировать раствор. Содержимое пробирки еще раз аккуратно перемешать. Выдержать 20 мин при 4 °С.