8. Значения максимумов поглощения (абсорбции) и испускания света (эмиссии) некоторых флуорофоров
Гибридизацию с использованием микрочипов, изготовленных промышленным способом, и соответствующих чип-детекторов, оснащенных лазерными сканерами, сейчас широко используют в медицине для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, наследственных (генетических) заболеваний; в пищевой промышленности для видовой идентификации растительного и животного сырья и качественного определения генетически модифицированных источников; в криминалистике для идентификации личности и, наконец, в фундаментальной науке для расшифровки геномов, построения генетических карт, исследования генеалогии и эволюции человека по распределению генетических мутаций у отдельных особей и для других крупномасштабных исследований.
В то же время практически во всех молекулярно-биологических лабораториях практикуются значительно более простые и менее технологичные разновидности метода ДНК—ДНК-гибридизации из-за их относительной простоты и одновременно высокой информативности.
Цель работы. Ознакомиться с методом дот-гибридизации на нейлоновой мембране.
Материалы и оборудование. 1. Гибридизатор или воздушный термостат. 2. Гель-документирующая видеосистема (с отраженным УФ-светом). 3. Латексные неопудренные перчатки. 4. Нейлоновая мембрана Нybond+. 5. Фильтровальная бумага. 6. Полиэтиленовый пакет с герметичной застежкой или центрифужная пробирка вместимостью 15 мл с крышкой для проведения гибридизации. 7. Раствор ДНК-мишени: 5—10 мкг/мкл (например, ДНК, выделенная из прокариот или эукариот — см. практические работы № 3—5). 8. Раствор ДНК-зонда: 5— 10 мкг/мкл (например, ПЦР-продукт, полученный с ДНК растительного или животного происхождения специфичными для гена 18S рРНК олигонуклеотидными праймерами, — см. практическую работу № 7 и каким-либо одним из дНТФ, меченным красителем РАМ). 9. Денатурирующийраствор:1,5МNаС1,0,5М NaОН.
10. Нейтрализующий раствор: 3 М ацетатный буфер рН 5,5. 11. 1 М раствор NaОН. 12. 0,4 М раствор NaОН. 13. 1М раствор НС1. 14. 0,1%-ный раствор ДДС— Nа. 15. Предгибридизационный раствор: 5х раствор Денхарда (готовится из 100х запасного раствора Денхарда: 2%-ный фиколл 400, 2%-ный поливинилпиролидон М.м. 360 000, 2%-ный БСА), 5х раствор SSРЕ (готовится из 20х запасного раствора SSРЕ: 3,6 М NaС1, 0,2 М Na3(РО4)2,0,02МЭДТА-Nа,рН8,3),0,2%-ныйДДС—Na, 500 мкг/мл негомологичной ДНК. 16. Отмывочный раствор:5мМ Nа3(РО4)2, 1 мМ ЭДТА—Nа, 0,2%-ный ДДС—Nа, рН 7,0. 17. 0,2 М трис-НСI буфер, рН 7,5.
Ход работы. Внимание! Все операции с мембраной производить только в перчатках!
Подготовка мембраны для дот-гибридизации. 1. Отрезают фрагмент нейлоновой мембраны Нybond+ размером приблизительно 2x4 см.
2. С помощью автоматического дозатора наносят на мембрану по 10 мкг каждой из ДНК-мишеней, растворенных в 1—2 мкл деионизованной воды. Внимание! Образовавшиеся влажные пятна не должны наползать друг на друга!
3.Помещают мембрану на фильтровальную бумагу, смоченную денатурирующим раствором выдерживают 5 мин.
4.Помещают мембрану на фильтровальную бумагу, смоченную нейтрализующим раствором выдерживают 5 мин.
5.Сушат мембрану 30 мин при комнатной температуре, положив на фильтровальную бумагу, затем 60 мин при 80 °С в термостате, поместив в него мембрану вместе с подложкой.
Предгибридизация (при использовании фрагмента гена 18S рРНК не применяется). 1. Добавляют к предгибридизацион- ному раствору 1/10 объема 1 М раствора NaОН, инкубируют 10 мин при 65°С (предгибридизационный раствор используют из расчета 4 мл на 100 см2 мембраны).
2.Нейтрализуют раствор добавлением 1/10 объема 1 М соляной кислоты.
3.Наливают полученный раствор в полиэтиленовый пакет (под размер мембраны или чуть больше) с застежкой или центрифуж- ную пробирку с крышкой. Помещают внутрь мембрану, инкуби- руют 1 ч при 65 "С.
Гибридизация и отмывка мембраны. 1. В полученный гибридизационный раствордобавляют20мклДНК-зонда и проводят повторную денатурацию, как описано в предгибридизации (пп. 1, 2). Если предгибридизацию не проводили, то продолжают гибридизацию с ДНК-зондом, как описано в предгибридизации (пп. 1—3) для негомологичной ДНК.
2.Переносят мембрану в отмывочный раствор (из расчета 250 мл на 100 см2) и отмывают, переминая пакет или вращая руками пробирку с мембраной в течение 30 мин, повторяют процедуру еще раз.
3.Проводят детекцию результатов гибридизации с использованием, например, гель-документирующей системы в УФ-свете.
Внимание! Если мембрану предполагается использовать повторно, не дают ей высохнуть! Хранить мембрану следует в герметичном пакете на фильтровальной бумаге, смоченной отмывочным раствором.
Очистка («раздевание») мембраны для ее повторного использования. 1. Промывают мембрану в 0,1%-ном растворе ДДС—№ 15—20 мин при 65°С и постоянном помешивании; в случае выявления большого количества метки на мембране рекомендуется промыть ее в 0,4 М растворе NaОН (30 мин при 45 °С и постоянном помешивании).
2.Помещают мембрану в 0,2 М трис-НС] буфер рН 7,5 с 0,1х SSРЕ и 0,1%-ный ДДС-Na на 30 мин при 45 °С.
3.Хранят мембрану в запаянном пластиковом пакете с 2х раствором SSРЕ при 4oС. Контрольные вопросы. 1. Что называют мишенью и зондом, каково их назначение? 2. Зачем ДНК-мишень и ДНК-зонд подвергают денатурации перед нанесением на мембрану? Почему точно так же обрабатывают РНКи одноцепочечные синтетические олиго-ДНК-зонды, если они участвуют в гибридизации? 3. Почему в ходе работы не используется предгибридизация с ДНК из спермы лосося? 4. Почему необходимо обязательно использовать перчатки при обращении с мембраной для гибридизации?
Задания.1.Сделать вывод о гомологии последовательности гена 18S рРНК животных, растений и микроорганизмов. 2. Опре- делить, в какой «цвет» будет окрашена мишень после проведения гибридизации предложенной ниже молекулы ДНК с четырьмя разными зондами:
Мишень (показана только одна цепь двухцепочечной молекулы):
