Практическая работа №11 днк—днк-гибридизация

Методы гибридизации нуклеиновых кислот основаны на способности олиго- и полинуклеотидов образовывать двухцепочечную структуру за счет образования водородных связей между ос татками комплементарных азотистых оснований: аденин + тимин (или урацил) и гуанин + цитозин. При соблюдении определенных условий, исключающих случайное неканоническое взаимодействие нуклеотидов, методы гибридизации нуклеиновых кислот позволяют выявить гомологию первичной структуры интересующей нас нуклеиновой кислоты (мишень) и зонда — олигонуклеотида с известной первичной структурой. Мишенью может служить, например, нативная ДНК (дот-гибридизация от англ. скл — точка, точечный), а также рестрикционные фрагменты ДНК (Сау- зерн-гибридизация) или фракционированные с помощью электрофореза молекулы РНК (Нозерн-гибридизация, рис. 12), а зондом — чаще всего ПЦР-продукт или рестрикционный фрагмент,меченный радиоактивным изотопом (чаще ³²Р или ³³Р) или флуоресцентным красителем для его последующей детекции. Использование радиоактивных изотопов становится все менее популярным из-за невозможности длительного хранения меток, трудностей детекции продуктов ядерного распада и определенного вреда,наносимого здоровью систематической работой с ними. Однако флуоресцентное мечение также имеет свои недостатки, это прежде всего высокая термолабильность как самой молекулы флуорофора, так и химической связи флуорофора с зондом, которая нарушается при нагреве—охлаждении, детекции коротковолновым или УФ-светом, а также в ходе длительного хранения.

К отдельной категории методов гибридизации следует отнести гибридизацию in situ, проводимую непосредственно на живом объекте, точнее, внутри прозрачных для детекции клеток, тканей, органов. Основное предназначение этого метода — определение клеточной и тканевой локализации РНК- или ДНК-мишени с уже известной первичной структурой или распределения определенных последовательностей ДНК в хромосомах. Метод позволяет установить, например, тканеспецифичность вирусов и бактерий (пораспределению их наследственного материала по клеткам и тканям организма-хозяина), экспрессии определенных генов (по наличию мРНК) и т. д. (рис. 13).

Рис. 12. Радиоавтограф мембраны после Нозерн-гибридизации, мишень — мРНК из растений разных фенотипов Arabidopsis Thaliana, зонд ³²Р-меченый олигонуклеотид

(Nam and Li, 2002)

Дот-гибридизация — самая простая разновидность ДНК— ДНК-гибридизации (мишень и зонд являются молекулами ДНК). ДНК-мишень не подвергают каким-либо модификациям, а только плавят (денатурируют) при 65 °С в 0,1-0,5 М растворе щелочи и закрепляют на специальной подложке — нитроцеллюлозой или нейлоновой мембране, реже на кварцевом стекле (рис. 14). Готовую мембрану с нанесенной на нее мишенью можно использовать многократно. ^:

Рис. 13. Микрофотографии кончика корня Arabidopsis Thaliana со светящимися (флу- оресцирующими) участками - локализацией искомой мРНК (Ishiguro а1., 2002):

А- F- последовательные стадии роста корня; S - главный корень; F - боковой корень

ДНК-зонд денатурируют тем же способом, затем раствор нейтрализуют и немедленно используют для гибридизации, в ходе которой гибридизационный раствор свободно омывает мембрану.При наличии протяженных гомологичных участков у мишени и зонда расплавленная ДНК, кроме реассоциации, может образовывать гетеродуплексы, состоящие из одной цепи ДНК-мишени и другой — ДНК-зонда (рис. 15).

Рис. 14. Схематичное изображение фрагмента поверхности мембраны с ДНК-ми- шенью — одноцепочечной ДНК (сайт Шр://а$утеТгЬс.сот):

1 — фрагмент поверхности (общий вид); 2 — увеличенная одноцепочечная ДНК-мишень

-

Если гомология мишени и зонда недостаточна для образования прочного гетеродуплекса, зонд вместе с меткой будет смыт с мембраны. Если же эта связь образована не менее чем 70 % пар нуклеотидов от всей длины зонда, она сохранится входепоследующих отмывок мембраны и будет выявлена после детекции — радиоавтографии или флуореграфии в точках, где нанесена соответствующая ДНК-мишень. Степень гомологии мишени и зонда, необходимую для их прочного взаимодействия, можно намеренно варьировать, создавая более или менее жесткие условия: чем выше тем-пература, рН, концентрация денатурирующих агентов (мочевина, формамид и др.), тем большая гомология требуется для гибридизации. Для того чтобы полностью исключить возможность связыва ния зонда с самой мембраной и создания фона, мешающего детекции, свободную от мишеней поверхность мембраны в ходе предгибридизации «закрывают» заведомо негомологичной ДНК (например, ДНК спермы лосося). Однако эта процедура может помешать эксперименту, если нет уверенности в различии первичной структуры у негомологичной ДНК и ДНК-мишени или ДНК-зонда. Поэтому некоторые исследователи намеренно не производят предгибридизацию.

В зависимости от чувствительности и разрешающей способности приборов для детекции меченой ДНК число мишеней, нанесенных на мембрану или другую подходящую основу, может сильно варьировать: от одного-двух до десятков и сотен тысяч,при этом линейные размеры основы для гибридизации могут не превышать размеров стандартного предметного стекла. Разумеется, отдельные мишени в последнем случае становятся микроскопическими (чипибридизация), и результат гибридизации детектируют уже в специализированных прибора—чип-детекторах. Более того, использование в одной гибридизации сразу нескольких зондов, меченных разными флуорофорами (различаются «цветом»—длиной волны испускаемого света, табл.8), повышает плотность результатов четырехкратно, поскольку в этом случае точки образования гетеродуплексов можно дифференцировать не только по расположению мишеней на подложке, но и по цвету (т. е. соответствующей последовательности нуклеотидов) связанного зонда (рис. 16).