7.Условия рестрикции

Фактор	Требование	Дополнительная информация
Рестриктаза	1. Тип — в зависимости от цели работы.	Для выявления сайтов использу- ют генетические карты или сек- венированные последовательно- сти ДНК
	При выборе необходимо знать,есть ли в используемой ДНКсайт или сайты узнавания для данной рестриктазы	Большой избыток активности рестриктазы или объема ее ра- створа, взятого на реакцию (бо- лее 1/10 конечного объема), мо- жет привести к уменьшению специфичности работы фермента
	2.Количество—в зависимости отколичества ДНК (1 ед.акт. фермента на 1 мкг ДНК). Длябольшей эффективности лучше использовать двух- или трехкратный избыток фермента
Буферный раствор	Состав: 1)трис-НС1 буферный раствор для поддержания рН (около 7,5); 2)МgС12 (ионы магния являются единственным кофактором рестриктаз класса II); 3)дитиотрейтол или 2-меркапто-этанол для стабилизации фер- мента с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА)как стабилизатора; 4) NaCI (или КС1) для создания необходимой ионной силы реак- ционной смеси	Для различных рестриктаз требу- ются определенные концентра- ции компонентов. Однако для удобства работы большинство ферментов было объединено в 4—5 групп и для каждой из них был унифицирован состав реак- ционного буфера (как правило, переменной величиной является концентрация ионов Na+)
ДНК	От 1 до 10 мкг, поскольку большие количества ДНК увеличивают вязкость раствора, что приво- дит к ингибированию реакции	ДНК должна быть очищена от реагентов, используемых полиса- харидов и РНК
Объем смеси	От 10 до 50 мкл	Для уменьшения испарения и поддержания постоянного объ- ема реакционной смеси добавля- ют вазелиновое масло
Температура	37°С для большинства рестриктаз	25 °С (для SmaI), 65 °С (для ре- стриктаз из термофильных бак- терий — ВstBI, Таg1 и др.)
Время	От 1 до 5 ч	Реакцию можно остановить с по- мощью ЭДТА—Na

Разделение полученных рестриктазных фрагментов и их визуа- лизацию проводят методом электрофореза в агарозном геле.

Цель работы. Ознакомиться с методом рестрикционного анали- за ДНК.

Оборудование и материалы. 1. Микроцентрифуга высокоскоростная до 10 000g. 2. Микроцентрифуга-вортекс до 2000g- 3. Термостат твердотельный для микро- пробирок вместимостью 0,5—1,5 мл. 4. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 5. Микропробирки вместимостью 0,5 мл. 6. Термостат твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 7. Рестриктаза ЕсоRI и буферный раствор для нее. 8. Раствор плазмидной ДНК (рGEM3Z) и ДНК фага λ. 9. Вода стерильная деионизованная. 10. Материа- лы и оборудование для проведения электрофореза, представленные в практичес- кой работе № 2.

Ход работы. 1. Смесь для рестрикции (общий объем — 40 мкл) готовят в микропробирке вместимостью 0,5 мл, поместив ее и все исходные компоненты в термостат с функцией охлаждения при 4°С:

10х буфер для рестриктазы ЕсоRI! — 6 мкл;

рестриктазаЕсоRI.(10ед.)— 2 мкл; вода стерильная деионизованная — 32 мкл.

Вышеперечисленные компоненты смешивают в указанных количествах, с помощью автоматического дозатора отбирают по 20 мкл смеси и переносят в две чистые микропробирки вместимостью 0,5 мл.

Внимание! При смешивании необходимо проводить смену наконечников после каждого раствора.

В пробирку 1 (промаркировав ее) добавляют 10 мкл раствора ДНК фага λ в концентрации 0,4 мкг/мкл, а в пробирку 2 (промаркировав ее) — 10 мкл раствора плазмидной ДНК (рGEM3Z) в концентрации 0,4 мкг/мкл.

2.Смеси в двух пробирках очень осторожно перемешивают с использованием дозатора с наконечником, добавляют 10 мкл минерального масла, центрифугируют 5 с при 2000g и выдерживают в термостате 1 ч при 37 ^oС.

3.Через 5, 20, 40 мин и по истечении 1 ч от начала рестрикции из пробирки 2 отбирают пробы по 5 мкл и переносят в чистые микропробирки вместимостью 0,5 мл, маркируя их при этом.

4.Каждую из отобранных проб сразу же смешивают с 5 мкл краски-лидера (из набора для электрофореза), помещают в термостат с функцией охлаждения при 4 °С и оставляют до тех пор, пока не будет отобрана последняя проба.

5.Четыре содержащие гидролизованную ДНК пробы, отобранные из пробирки 2, а также пробу из пробирки 1 (аналогично смешанную с краской-лидером) вносят в лунки пластины агарозного геля и подвергают электрофорезу для исследования динамики ре-стрикции (см. практическую работу № 2).

6.Полученные результаты регистрируют визуально или с ис- пользованием видеосистемы.

Контрольные вопросы. 1. Какова функция рестриктаз в клетках бактерий? 2. Каковы принципы деления рестриктаз на классы? 3. Что такое сайт рестрикции? 4. Какие сайты рестрикции узнают рестриктазы II класса? 5. По какому принципу делят II класс на подклассы? 6. Каковы основные условия проведения рестрик- ции? 7. Какой показатель принимают за единицу активности рестриктазы?

Задания.1.Поместить схему или фотографию полученной электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Проанализируйте динамику рестрикции ДНК рGEM3Z при действии рестриктазы ЕсоRI (по результатам рестрикции с разными сроками инкубации).