Практическая работа №10 рестрикционный анализ днк
Рестриктазы — это ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью, которые специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов — сайтов рестрикции. Название этих ферментов происходит от английского гезгпсИоп (ограничения); они были выявлены у определенных штаммом бактерий. Крайне редко помимо эндонуклеазной активности рестриктаза обладает еще и метилазной (Есо571), производя модификацию (метилирование) определенных нуклеотидов в последовательности, узнаваемой рестриктазой; такие модифицированные последовательности не подвержены ферментативной рестрикции. Но обычно эти фер-менты структурно независимы и работают в комплексе, образуя так называемую КМ-систему (систему рестрикции—модификации). Одновременное наличие в клетке обеих ферментативных активностей защищает от интеграции в геном чужеродной ДНК (например, вирусов или плазмид) и предотвращает разрушение собственной ДНК.
Известно около 2500 рестриктаз. Название того или иного фермента составляется из первой буквы рода и двух первых букв вида бактерии, из которой данная рестриктаза выделена, еще одна буква может обозначать тип штамма. Если в определенном штамме клеток имеется несколько рестриктаз, то к буквенному названию фермента добавляется числовое обозначение. Например — рестриктаза Hind III выделена изклеток Haemophilus influenzae с серотипом d и относится к III классу RМ-системы.
Рестриктазы могут кодироваться не только геномной ДНК бактерии, но также плазмидами и фагами, в связи с этим к названию фермента добавляется название внехромосомного элемента (ЕсоRI).
С учетом основных свойств рестриктазы подразделяют на четыре класса.
Рестриктазы I классадействуют в одном комплексе с метилазами, расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от несимметричных сайтов узнавания. При этом образуется сплошной спектр рестриктов, не детерминированных по размерам и содержанию информации, поэтому данные рестриктазы в генной инженерии не используют. Примером таких рестриктаз может служить ЕсоК.
Рестриктазы II класса имеют широкое применение, поскольку рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо, сайты узнавания совпадают с сайтами расщепления или находятся рядом с ними на определенном расстоянии, в результате чего получаются фрагменты ДНК воспроизводимого состава и длины (рис. 10).
Более половины рестриктаз данного класса узнают нуклеотидные последовательности с вращательной симметрией второго порядка (палиндромы). По способу расщепления данные ферменты делятся на два подкласса. Представители первого осуществляют ступенчатый разрез комплементарных нитей ДНК, в результате чего образуются фрагменты с выступающими (липкими) концами: либо 5'-концами (рис.10,Б),либоЗ'-концами,как в случае действия рестриктазы PstI (рис. II, А)- Ферменты второго подкласса (например, SmaI) расщепляют совпадающие связи, в результате чего образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис. 11, В).
Рестриктазы III класса (например, ЕсоPI) действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов, при этом расщепление происходит на определенном расстоянии от сайта узнавания.
R.М-система (комплекс рестриктазы и метилазы) IV класса представлена пока уникальным ферментом Есо57I, в одной поли- пептидной цепочке которого и эндонуклеазная, и метилазная ак- тивность.
Рестриктазы широко используют в работах по генной инжене- рии, в частности по картированию геномов, клонированию, оп- ределению нуклеотидных последовательностей (секвенирова- нию).
За единицу активности рестриктазы принимают количество фермента, способное за 1 ч в оптимальных для него условиях полностью гидролизовать 1 мкг ДНК фага λ. Для проведения успешной рестрикции необходимо соблюдать ряд условий,которые приведены в таблице 7.