Практическая работа №7 постановка полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации(умножение числа копий) фрагментов нуклеиновых кислот туйго, с помощью которого можно избирательно и быстро получить миллионы копий определенных (целевых) нуклеотидных последовательностей. Этот метод, разработанный К. Мюллисом и Р. Сайки в 1985—1988 гг., был назван выдающимся изобретением века, а авторам его присудили Нобелевскую премию. Внедрение его позволило ускорить реализацию программы «Геном человека»,а также способствовало внедрению в практику клинической диагностики наследственных и паразитарных заболеваний высокоэффективных тестов нового поколения. В ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Ткегтт адиаНсш (Тад-полимеразу), которая в присутствии четырех видов дезоксирибонуклеозидтри-фосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) и коротких 20—30-членных затравок (праймеры) осуществляет синтез омплементарныхпоследовательностей ДНК. В качестве матрицы для ПЦР используют тотальную ДНК или чаще ее фрагменты, полученные из исследуемого материала. В ходе ПЦР проводят термическую денатурацию двухцепочечной молекулы (фрагмент) ДНК при 93—95 °С,после чего пробы охлаждают до 60 "С, что дает возможность праймерам связаться с одноцепочечной ДНК. Праймеры подстраиваются сами (по комплементарному принципу) к денатурирован- ным нагреванием гомологичным участкам одноцепочечных фрагментов исходной «материнской» ДНК и служат для двух целей: запускают работу Тод-полимеразы и одновременно ограничивают рост цепи ДНК, как бы застопоривают фермент в рамках нужного участка копирования ДНК. ПЦР имеет циклический характер. В первом и частично во втором циклах образуются копии (ампликоны), не соответствующие границам амплифицируемого гена (все ампликоны в первом цикле и часть ампликонов во втором цикле получаются более протяженными в тех участках, где еще не произошло связывание второго, ограничивающего рост цепи праймера). Начиная с третьего цикла длина ампликонов становится стандартной, т. е. соответствует числу пар нуклеотидов ДНК-матрицы между З'-концами праймеров. Ампликоны накапливаются в геометрической прогрессии. Процесс имеет цепной характер, так как интезированные ампликоны в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30—40 раз, можно за 1,5—3 ч получить миллионы копий гена (2", где п — число циклов амплификации) (рис. 6).

Подбор и оптимизация праймеров для ПЦР. Праймеры используют, как правило, попарно и подбирают их такимобразом,чтобы они были комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область, и ориентированы З'-кон-цами в направлении последовательности, которую необходимо амплифицировать, т. е. навстречу друг другу (рис. 7). >

Оптимизация праймеров для ПЦР сводится к их «дизайну» (выбору нуклеотидной последовательности) и определению оптимальной температуры для их отжига (связывание с ДНК-матрицей). Дизайн праймеров (т. е, выбор определенного участка на

Рис. 7. Схема расположения ираймеров на ДНК-матрице для избирательной (специфической) амплификации целевого фрагмента

ДНК-матрице для связывания с праймером) по известной ДНК- матрице производится в соответствии со следующими рекомендациями:

Выбор участка на Д Н К-м а т р и ц е. Это один из са-мых важных шагов в планированииэксперимента.Необходимо,чтобы пара праймеров эффективно и специфично связывалась с искомой целевой последовательностью. Других вариантов связывания праймеров с ДНК-матрицей быть не должно, по крайней мере для той ДНК, которую необходимо выделить из исследуемого материала (например, в пробах из крови человека будет присутствовать ДНК человека, возможно также ДНК некоторых микроорганизмов и простейших, но маловероятно присутствие геномной ДНК другого животного и тем более растения).

Информацию о последовательности нуклеотидов целевого фрагмента (или только его концов) можно получить в базе данных международного генбанка(доступнанавеб-сайт\у\у\у.псЫ.п1гп.шп.§оу). Длина целевого фрагмента должна быть в пределах 100—3000 п.н., нижний предел обусловлен возможностью отделения амплифицированных фрагментов (ампликоны)отдимеров праймеров и других неспецифических фрагментов нэлектрофорезе, верхний предел — возможностями 7Ъ#ДНК-полимеразы, не способной эффективно синтезировать фрагменты большей длины.

Оптимальная длина праймеров. Этот показатель определяется возможностью отжига праймера одновременно по всей его длине и находится между 16 и 25 нуклеотидами и в среднем составляет 18—20 нуклеотидов.

Содержание ГЦ (ОС), %. Это отношение числа нуклеотидов дГ и дЦ (суммарно) к общему числу нуклеотидов праймера. Необходимо подбирать последовательность праймера так, чтобызначение величины ОС (%) находилось между 35 и 65 (некоторые источники предлагают 45—55) и было приблизительно одинаковым у праймеров, составляющих пару для ПЦР. Ни в коем случае не должно оказаться несколько (3 и более) оснований дГ и дЦ подряд на З'-конце праймера: это сильно снижает его специфичность. В идеале все четыре нуклеотида должны быть более или менее равномерно распределены по всей длине праймера.

Температура отжига (Т_апп°С). Это температура, при которой вероятность связывания праймера с ДНК-матрицей превосходит 70 %. Для пары праймеров она на 4—5 "С (по некоторым источникам на 2—4°С) ниже температуры плавления (Т_т°С) — температуры, при которой число связанных с ДНК и свободных олигонуклеотидов одинаково. Оптимальная температура отжига должна находиться в пределах 50—70°С (хотя в некоторых случаях может быть и ниже) и не может различаться у праймеров, составляющих пару для ПЦР, более чем на 4 "С.

Рассчитать температуру плавления для подобраных праймеров (°С) можно по формулам

Т_т = 2(АТ)+4(ГЦ) — для праймеров до 20 н.; Т_т = 69,3+0,41(% GС)-650/Í, — для праймеров более 20 н.,

где 1 — длина праймера.

Ориентировочную температуру отжига для каждой пары праймеров можно рассчитать, исходя из минимальной температуры плавления (на 2—4 "С ниже), рассчитанной для каждого их двухпраймеров, но точно ее установить можно только эмпирически по результатам серии ПЦР, проведенных с разной температурой отжига, начиная с расчетной и ниже с шагом 1—2 "С.

Вторичная структура праймеров и целевого фрагмента. Связывание праймеров с матрицей будет затруднено, если в месте связывания цепь ДНК может образовывать вторичные структуры — гомо-, гетеродимеры и петли. В связи с этимнеобходимо подбирать праймеры так, чтобы составляющие пару олигонуклеотиды не содержали в своем составе последовательности из 3 и более нуклеотидов подряд, комплементарных аналогичной последовательности этого же (гомодимер) или другого (гетеродимер) праймера, а также палиндромных последовательностей,являющихся причиной образования петель. Заранее предвидеть вторичную структуру целевого фрагмента (ампликон) практически невозможно, поэтому для его эффективной амплификации часто требуется испытать не одну, а две—четыре и более пар праймеров, пока не будет достигнут искомый результат

Расчет количества праймеров для ПЦР-смеси. Производители,синтезирующие праймеры на заказ, как правило, указывают концентрацию праймера в полученном растворе, например 33 пмоль/мклили 33 мМ. Для приготовления реакционной смеси требуется, какправило, 5—10 пмоль каждого из пары праймеров. Исходя из этой величины и концентрации праймера, определяют объем исходного раствора праймера, который необходимо добавить в реакционную смесь, по формуле

Объем раствора праймера, мкл = -

Требуемое количество праймера, пмоль

Концентрация праймера, пмоль/мкл

При этом нет необходимости оперировать с очень малыми объемами (1 мкл и менее) раствора праймеров и других компонентов реакционной смеси для ПЦР, поскольку это практически невозможно реализовать. Объем исходного раствора праймеров рассчитывают и добавляют к суммарному объему реакционной смеси, приготовленному для 10 и более реакций, или разбавляют исходный раствор стерильной деионизованной водой до требуемой концентрации и смешивают оба праймера в одной пробирке (только аликвоты, а не весь объем исходных растворов праймеров!).

Приготовление реакционной смеси и проведение ПЦР. Помимо ДНК-полимеразы (1 ед. акт/реакцию), праймеров и ДНК-матрицы в реакционной смеси должны присутствовать: 1) смесь всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов в конечной концентрации,как правило, 0,25 мМ каждого; 2) катионы Мg²⁺ как необходимый кофактор ДНК-полимеразы (используют раствор МgС1₂ в конечной концентрации 1,5—3 мМ, оптимальную концентрацию подбирают экспериментально в соответствии с применяемым типом ДНК-полимеразы и числом одновременно амплифицируемых продуктов); 3) 5—10 мМ трис-ЯС\ буферный раствор рН 8—10 (обычно прилагается к любому коммерческому препарату ДНК- полимеразы и оптимизирован для нее); 4) соли КС1, NaСIдля обеспечения необходимой ионной силы раствора входят в состав буферного раствора для ДНК-полимеразы; 5) неионный детергент Тweп20 для предотвращения адсорбции молекул ДНК-полимеразы на стенках реакционной посуды (как правило, пробирки из полиэтилена); 6) иногда дополнительно бычий сывороточный альбумин (БСА), ди- и олигосахариды для стабилизации ДНК-полимеразы, формамид (для повышения специфичности гибридизации праймеров с ДНК-матрицей) и др.

Таким образом, очевидно, что типичная процедура «сборки» смеси для ПЦР весьма сложна (доступна только опытному оператору), продолжительна (что критично для сохранения реагентов в неразрушенном состоянии) и требовательна к точности (иначе невозможно обеспечить воспроизведение результатов). Поэтому в посление 10—15 лет для ПЦР широко применяют готовые к употреблению смеси, включающие все необходимые компоненты, кроме праймеров (но, например, наиболее широко употребимые ПЦР-смеси для обнаружения ДНК патогенной микрофлоры содержат также и праймеры) и ДНК-матрицы, жидкие или лиофилизированные. Одной из таких является предлагаемая для практикума смесь «ПЦР-ядро» производства ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ».

В ходе ПЦР каждая из вновь синтезируемых с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью другого праймера. Для этого надо денатурировать образовавшиеся на первой стадии реакции двухцепочечные молекулы ДНК, дать возможность новым праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить синтез (элонгацию).

Цикл ПЦР (амплификация) включает:

этап 1 — денатурация (плавление) ДНК-матрицы при 92—95 °С;

этап 2 — связывание (отжиг) праймеров с одноцепочечными фрагментами ДНК-матрицы при 55—65 °С;

этап 3 — ферментативный синтез комплементарных цепей ДНК (элонгация) при 72 °С.

Следующий цикл ПЦР составляют те же самые этапы, причем матрицей для синтеза новых молекул ДНК может служить каждая из вновь синтезированных цепей ДНК. В результате ПЦР приведет к экспоненциальному росту количества именно таких, ограниченных с двух сторон праймерами, молекул ДНК (см. рис. 7). Реализовать все шаги цикла в автоматическом режиме позволяют специальные приборы — термоциклеры (программируемые термостаты, амплификаторы).

Для упрощения процедуры приготовления реакционной смеси для ПЦР созданы специальные наборы реагентов для амплификации, включающие все необходимые компоненты, в том числе ДНК-полимеразу, которые уже смешаны в нужных пропорциях. В реакционную смесь для ПЦР требуется добавить лишь ДЩС-матрицу и праймеры (в некоторых случаях праймеры также могут входить в состав наборов), что существенно экономит рабочее время и снижает вероятность ошибок и контаминации.

Известно, что чувствительность ПЦР может достигать теоретически возможного предела (единичная молекула ДНК-матрицы).Это позволяет выявлять целевой фрагмент, используя микроскопически малые количества исходного материала. Однако у этой полезной особенности ПЦР есть и оборотная сторона — высокая степень опасности получения ложноположительных результатов из-за контаминации, т. е. загрязнения реакционной смеси посторонней ДНК-матрицей или амплифицированными фрагментами(ампликонами).

Основные причины получения ложноположительных результатов при постановке ПЦР таковы:

перекрестная контаминация от пробы к пробе (например,впроцессе обработки клинических образцов или при раскапыванииреакционной смеси);

контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими копии клонированной последовательности целевого фрагмента (эти плазмиды чаще всего используются в качестве положительного контроля ПЦР);

контаминация ампликонами — наиболее частая причина ложноположительных результатов, так как в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями, через приборы, инструменты, одежду и т. д.

Цель работы. Ознакомиться с методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Оборудование и материалы. 1. Термоциклер (ДНК-амплификатор). 2. Микроцентрифуга-вортекс (до 2000#). 3. Термостат твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью 0,5—1,5 мл. 4. УФ-бокс. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Материалы и оборудование для проведения электрофореза, представленные в практической работе № 2. 7. Набор реагентов для амплификации ДНК (ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»): микропробирки, содержащие лиофилизированную амплификационную смесь «ПЦР-ядро»; ПЦР-растворитель; смесь праймеров (например, для определения фрагмента гена 185 рРНК) готовят самостоятельно или входит в состав смеси; положительный контроль (раствор стандартной ДНК) подбирается самостоятельно или входит в состав смеси; масло минеральное. 8. Растворы ДНК-матрицы (образцы ДНК, выделенные из прокариот или эукариот — см. практические работы № 3—5). 9. Вода дистиллированная. 10. Перчатки резиновые или латексные, неопудренные.

Ход работы. Внимание! Все манипуляции производить только в перчатках! Наконечники для автоматического дозатора необходимо использовать однократно!

1. Извлекают из пакета необходимое количество пробирокПЦР-ядро (оно равно числу анализируемых проб плюс положительный и отрицательный контроль), размещают их в штативе и маркируют. Обратите внимание, на дне каждой пробирки находится лиофилизированная смесь синего цвета, которая затем должна быть полностью растворена. Положительным контролем (К+) служит раствор, образуемый стандартной ДНК (см. далее). Отрицательный контроль (К—) — ТЕ-буфер из комплекта, спользован-ного для выделения ДНК.

2. Добавляют в каждую пробирку ПЦР-ядро по 10 мкл ПЦР-растворителя.

3. Добавляют в каждую пробирку ПЦР-ядро 5 мкл смеси праймеров, например для определения гена 18S рРНК:

прямой праймер (1): 5'-АGC САТ GСА ТGТ GТА АGТ АТG ААС G-З',

обратный праймер (2): 5'-GСС СGG ТАТ ТGТ ТАТ ТТА ТТG ТСА СТ-3'.

Можно предложить измерить концентрацию праймеров и приготовить их рабочую смесь, содержащую по Юпмоль каждого праймера в 5 мкл раствора, самостоятельно следуя указаниям, которые изложены в практической работе № 6. Аналогично пригото-вить положительный контроль, используя раствор ДНК (20—50 нг/мкл), выделенной из растительной или животной ткани любым из приведенных ранее способов.

4. Содержимое пробирок перемешивают, встряхивая на вортексе, до полного растворения сухих компонентов смеси. Обычно для этого требуется 5-10 мин, после чего жидкость в пробирке должна равномерно окраситься в синий цвет.

5. Добавляют в пробирки с амплификационной смесью:

• в пробирку с маркировкой К— (отрицательный контроль) — 5 мкл ТЕ-буфера из комплекта, использованного для выделения ДНК;

• в пробирки с маркировкой №... (исследуемые образцы) — по 5 мкл пробы соответствующей ДНК-матрицы;

• в пробирку с маркировкой К+ (положительный контроль) — 5 мкл раствора стандартной ДНК.

6. Содержимое всех пробирок еще раз аккуратно перемешивают.

7. Во все пробирки добавляют по 20-25 мкл (две капли) минерального масла, пробирки плотно закрывают крышечками.

8. Пробирки центрифугируют 5—7 с при 2000g. При этом отдельные капли ПЦР-смеси, оказавшиеся при ее перемешивании на стенках и крышке пробирки, должны быть сброшены на дно, а сверху ровно наслоено минеральное масло.

9. Пробирки с готовой ПЦР-смесью помещают в амплификатор и запускают программу амплификации (контроль температуры в термоблоке амплификатора должен осуществляться в режимеактивного регулирования температуры):

94 °С — 3 мин;

35 циклов, включающих:

94 ^oС (денатурация) — 40 с,

58 ^oС (отжиг праймеров) — 30 с,

72 °С (элонгация) — 40 с;

72 °С — 4 мин.

7. По окончании амплификации пробирки извлекают из амплификатора, помещают в штатив и переносят в зону для электрофореза продуктов ПЦР.

ПЦР-продукты (ампликоны) можно использовать в других практических работах и хранить в течение 1—2 нед при —18 °С.

11. Детекцию результатов ПЦР производят с помощью электрофореза в агарозном геле (практическая работа № 2). \

12. Полученные результаты регистрируют визуально или с помощью видеосистемы.

Контрольные вопросы. 1. Каков принцип метода ПЦР? 2. Из каких этапов состоит цикл ПЦР? 3. Из каких компонентов состоит реакционная смесь? 4. Каковы основные причины получения ложноположительных результатов при проведении ПЦР? 5. Какие контроли и с какой целью используют при постановке ПЦР? 6. В какой очередности осуществляют внесение образцов и контролей в ПЦР-смесь? 7. Как должны выглядеть зоны положительного и отрицательного ПЦР-контролей на геле? 8. В каком случае образцы следует считать положительными или отрица-тельными? 9. В каком случае результаты ПЦР-анализа считаются недействительными?

Задания. 1. Поместить схему или фотографию полученной электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Сделать вывод о наличии или отсутствии фрагмента гена 185 рРНК в исследуемых образцах ДНК и определить его примерную молекулярную массу. 3. Подобрать пару праймеров для амплификации фрагмента ДНК длиной около 1000 п.н. по заданной матрице: