5. Раствор I для выделения плазмидной днк

Запасной раствор		Рабочий раствор (1 мл)
		Требуемый объем	Конечная концентрация
1 М трис-НС\ рН 8 0,5 М ЭДТА-Ыа, рН 8 Вода дистиллированная 6. Раствор	25 мкл 25 мМ 20 мкл 10 мМ До 1 мл (0,55 мкл) — II для выделения плазмидной ДНК
Запасной раствор		Шючий раствор (2 мл)
		Требуемый объем	Конечная концентрация
1 М №ОН 10%-ный ДЦС-Ыа Вода		0,4 мл 0,2 мл 1,4 мл	0,2 М 1%

2. Колонии клеток кишечной палочки, выращенные на твердой питательной среде (при 37°С в течение ночи), собирают при помощи микробиологической петли с '/₈—Ую части поверхности чашки Петри, суспендируют в 500 мкл дистиллированной воды в микропробирке вместимостью 1,5 мл."'3. Суспензию клеток центрифугируют 3 мин при 4000 #.

4. Супернатант отделяют декантацией, осадок ресуспендируют в 200 мкл раствора I и выдерживают 5—7 мин при комнатной температуре. К клеточной суспензии прибавляют 400 мкл раствора II и перемешивают быстрым пятикратным переворачиванием закрытой пробирки без встряхивания (содержимое при этом должно быть вязким и прозрачным), затем пробирку выдерживают 5 мин при 0—4 °С

6. К суспензии добавляют 200 мкл 5 М раствора ацетата калия (рН 4,8), содержимое пробирки перемешивают до формирования творожистого осадка, а затем выдерживают 5 мин при 4 °С в термостате с функцией охлаждения.

7. Содержимое пробирки центрифугируют 5 мин при 10 000 #.

8. Супернатант переносят в чистую микропробирку вместимостью 1,5 мл, добавляют 600мк лизопропанола (для осаждения ДНК) и аккуратно перемешивают, плавно переворачивая плотно закрытую пробирку.

9. Полностью однородный раствор инкубируют 10—15 мин при комнатной температуре до появления беловатой хлопьевидной взвеси в толще прозрачного раствора.

10. Содержимое пробирки центрифугируют 10 мин при 10 000 #.

11. Супернатант полностью удаляют, а полученный осадок ДНК промывают в 100 мкл 70%-ного этанола, который затем полностью удаляют из пробирки.

12. Осадок ДНК подсушивают при 37°С, поместив открытую пробирку в термостат на 10 мин.

13. Высушенный осадок ДНК растворяют в 100 мкл буфера ТЕ.

14. Контроль качества выделенной ДНК производят с помощью электрофореза в агарозном геле (см. практическую работу № 2). При этом для нанесения на гель требуется 5 мкл раствора полученной пДНК. В качестве контрольных образцов вносят 5 мкл образцов ДНК плазмиды рСЕМ-32 (2743 п.н.) в концентрации 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мкл, а также 5 мкл ДНК плазмиды рОЕМ-72Г(3000 п.н.).

15. Полученные результаты регистрируют визуально или с помощью гель-документирующей видеосистемы.

Контрольные вопросы. 1. Какими формами представлена ДНК бактериальной клетки? 2. Какие участки плазмид отвечают за репликацию? 3. Каков принцип щелочного метода разделения плазмидной и хромосомной ДНК? 4. Какие вещества применяют для очистки ДНК от РНК и белков? 5. Какое вещество используют для осаждения ДНК?

Задания. 1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Сравнить электрофоретическую подвижность выделенной пДНК и ДНК плазмид рСЕМ-32, рСЕМ-72г", определить по электрофореграмме размер выделенной плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 3. Сравнить интенсивность свечения в ультрафиолетовом свете выделенной пДНК и контрольных образцов ДНК плазмиды рСЕМ-32 разной концентрации, определить по электрофореграмме примерную концентрацию выделенной плазмидной ДНК.