Лабораторная работа № 3

Тема:	Сложные белки. Методы выделения белков в гомогенном состоянии. Количественное определение белка. Определение белка неизвестной концентрации.
Цель работы:	Овладение методиками и подходами, используемыми при выделении и очистке белков Овладение методами количественного определения белка в биологическом материале: биуретовый метод, методы Лоури и Бредфорд

Оборудование и материалы:

• Спектрофотометр SOLAR

• Центрифуга К-24

• Центрифуга настольная

• Кюветы стеклянные

• Термостат

• Баня песочная

• Пипетки стеклянные на 1 мл и 5 мл

• Микропипетки автоматические

• Цилиндры мерные на 250 мл и 100 мл

• Колбы емкостью 250 мл и 100 мл

• Пробирки

• Штативы для пробирок

• Бумага фильтровальная

• Индикаторная бумага универсальная

• Бумага миллиметровая

Реактивы:

• Молоко

• Кровь цельная

• Биуретовый реактив

• Реактив Брэдфорд

• раствор А (2%-ный Na₂CO₃ в 0,1М NaOH)

• раствор Б (0,5%-ный CuSO₄·5Н₂О в 1%-ном тартрате натрия (или калия)

• Коммерческий реактив Фолина

• Бензидин, раствор

• Перекись водорода (Н₂О₂), 3% раствор

• Молибденовый реактив:

молибдат аммония ([NH₄]₂MoO₄), 15% раствор / HNO₃ ( конц.) в отнош. 110/ 90

• Гидроксид натрия (NaOH), 5 М раствор

• Карбонат натрия (Na₂CO₃), 0,1% раствор

• Сульфат аммония ([NH₄]₂SO₄), насыщенный раствор

• Эфир диэтиловый

• Спирт этиловый, 96%

• Спирт метиловый

• Хлороформ

• Уксусная кислота, ледяная, 0,1% раствор

• Азотная кислота (HNO₃), концентрированная

• Серная кислота (H₂SO₄), концентрированная, 10 М раствор

• Стандартные растворы белка (БСА) №1, 2, 3

• Растворы белка разных концентраций (исследуемые образцы)

• Вода дистиллированная

Теоретическая часть

Сложные белки

Сложные белки состоят из полипептидных цепей, построенных из аминокислот, а также включают компоненты не аминокислотной природы, представленные кофакторами и простетическими группами. В зависимости от химической природы простетической группы сложные белки делят на несколько классов:

Хромопротеиды представляют собой сложные белки, состоящие из белковой части и связанного с ней окрашенного небелкового компонента – простетической группы. Различают железопорфирины или гемопротеиды (содержат в качестве простетической группы гем), магнийпорфирины и флавопротеиды. Хромопротеиды участвуют в таких процессах жизнедеятельности, как транспорт кислорода и углекислого газа, клеточное дыхание, окислительно-восстановительные реакции, фотосинтез, свето- и цветовосприятие.

Гликопротеиды – это сложные белки, простетическая группа которых представлена углеводами. Углевод соединяется с белковой частью ковалентными связями. В присоединении углеводного фрагмента принимают участие OH-группы остатков серина или треонина. Этим белкам принадлежит важная роль в структурной организации клеток и тканей, они также выполняют защитные функции (к гликопротеидам относятся иммуноглобулины).

Липопротеины. Простетической группой липопротеинов являются липиды. Такие липид-белковые комплексы обеспечивают транспорт липидов в крови, липопротеины являются компонентами биологических мембран. В образовании липопротеинов принимают участие гидрофобные или ионные взаимодействия, возникающие между белковой частью молекулы липопротеина и липидом.

Металлопротеиды. В данных белках простетическая группа представлена металлом. Эти сложные белки транспортируют или участвуют в депонировании соответствующих ионов металлов. В составе металлопротеидов простетическая группа образует с аминокислотными радикалами белка координационные связи. К наиболее известным представителям металлопротеидов относятся: а) ферритин, содержащий до 20% трехвалентного железа, выполняет функцию депо железа в организме. Основное количество ферритина содержится в печени и селезенке. Некоторая часть этого белка находится в плазме крови; б) трансферрин, содержит около 0,13% железа и выполняет роль переносчика железа, которое в молекуле белка непрочно связано с ОН-группой тирозина. Каждая молекула трансферрина связывает два иона двухвалентного железа. К металлопротеидам относят также ряд ферментов, в которых атом металла входит в состав активного центра и непосредственно участвует в выполнении катализа. Примерами таких металлопротеидов являются цинк содержащая карбоксипептидаза А, медь содержащая цитохромоксидаза, использующая для катализа селен глутатионпероксидаза, митохондриальная форма супероксиддисмутазы включающая ион марганца, цитозольная форма этого фермента включающая медь или цинк.

Фосфопротеиды. Простетической группой этих сложных белков является остаток ортофосфорной кислоты. Примерами ферментов, содержащих в активном центре остаток ортофосфорной кислоты, который принимает непосредственное участие в катализе являются фосфоглюкомутаза, обеспечивающая образование глюкозо-6-фосфата из глюкозо-1-фосфата, фосфоглицеромутаза превращающая 3-фосфоглицерат в 2-фосфоглицерат и дифосфоглицеромутаза обеспечивающая образование 2,3-дифосфоглицерата из 1,3-фосфоглицерата и 3-фосфоглицерата.

Присоединение или отщепление остатков фосфорной кислоты характерно для процессов фосфорилирования и дефосфорилирования белков, которые играют важную роль в системах регуляции метаболических путей. Этот механизм позволяет контролировать активность ряда жизненно важных ферментов. Примером может служить первый фермент, участвующий в мобилизации гликогена – гликогенфосфорилаза, которая обеспечивает фосфоролиз данного полисахарида в печени. Фосфорилирование одного из остатков серина обеспечивает активацию этого фермента, при отщеплении фосфатной группы происходит его инактивация. Во многих случаях цикл фосфорилирования/дефосфорилирования белков зависит от функции аденилатциклазной системы. Любое воздействие сАМР на такие процессы, как стероидогенез, секреция, транспорт ионов, метаболизм углеводов и жиров, индукция ферментов, регуляция транскрипции генов, рост и деление клеток регулируются активностью специфических протеинкиназ или специфических протеинфосфатаз, либо доступностью субстратов для фосфорилирования. Многие белки, в том числе казеин, гистоны и протамины могут также подвергаться фосфорилированию.

Нуклеопротеиды. Простетическая группа у таких белков – нуклеиновая кислота. Различают дезоксирибонуклеопротеины (простетическая группа – ДНК) и рибонуклеопротеины (простетичесая группа – РНК). Им принадлежит важная роль в хранении, передаче и реализации генетической информации. Между белком и молекулой нуклеиновой кислоты образуются ионные связи.