Физико-химические свойства белков

Белки представляют собой макромолекулы, содержащие большое количество кислых и оснóвных функциональных групп. Кислые свойства белка определяются, главным образом, присутствием карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот, а также фенольных, гидроксильных и сульфгидрильных групп. Аминные, гуанидиновые, имидазольные и амидные-группы аминокислот придают белкам оснóвные свойства. На кислотно-щелочные свойства белка, в целом, влияет также характер соединения остатков аминокислот в белковой молекуле. Обладая одновременно кислотными и оснóвными свойствами, белки образуют биполярные ионы. Важнейшим фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов. Снижение рН среды уменьшает кислотную диссоциацию белка и переводит его в катион и, наоборот, повышение рН понижает щелочную диссоциацию и переводит белковые частицы в анионы.

При определенном значении рН (неодинаковом для различных белков) кислотная и щелочная диссоциации уравниваются, в результате суммарный заряд белка в целом может стать равным практически нулю. В этих условиях молекула белка находится в изоэлектрическом состоянии и утрачивает способность перемещаться в электрическом поле. Значение рН раствора, при котором молекула белка находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка. При значении рН раствора, соответствующем изоэлектрической точке, белок существует в виде амфотерного иона, несущего суммарные одинаковые по величине как положительный, так и отрицательный заряд. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральному значению рН среды, но несколько сдвинута в кислую сторону. Это объясняется тем, что кислотные свойства белков преобладают над щелочными и в растворе с нейтральным рН они реагируют как слабые кислоты. Молекулы таких белков содержат больше дикарбоновых аминокислот, чем положительно заряженных. Некоторые белки, наоборот, относительно богаче оснóвными аминокислотами, поэтому при нейтральном рН они ведут себя как слабые основания. Такие белки (например, гистоны и протамины) имеют изоэлектрическую точку в слабощелочном растворе.

Изоэлектрическая точка зависит от ионной силы и вида используемого буфера, так как компоненты буферного раствора оказывают влияние на степень ионизации ионогенных групп боковых радикалов аминокислот:

белок-катион ↔ белок-цвиттерион ↔ белок-анион

Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы. В этом случае сила отталкивания одноименно заряженных групп, повышающая устойчивость белкового раствора, уменьшается, и в качестве основного фактора стабилизирующего раствор белка выступает лишь гидратная оболочка биополимера. При этом возрастает спонтанная преципитация белковых молекул, понижающая его растворимость. В таких условиях белки, обладающие гидрофобными свойствами (например, казеин), то есть не имеющие водной оболочки, выпадают в осадок даже без дополнительных воздействий.

Растворимость белков

Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, то есть наличием в растворе других растворенных веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

Явление денатурации

Денатурацией называют существенное изменение третичной и вторичной структуры белка, связанное с нарушением, разупорядочиванием нековалентных взаимодействий без разрушения ковалентных связей. Данный процесс наблюдается при воздействии различных физических (нагревание) и химических (кислоты, ионы тяжелых металлов, спирты и так далее) факторов на растворы белков. При этом белки часто переходят в нерастворимое состояние вследствие агрегации молекул. В ряде случаев такие изменения являются обратимыми, и при прекращении воздействия молекулы белка возвращаются в свое исходное состояние. При этом растворимость белков восстанавливается. Такой процесс носит название ренатурации белка.

Тепловая денатурация

Почти все белки денатурируют при нагревании (исключением является, например, желатин). Этот процесс носит необратимый характер. Температура денатурации для разных белков различна. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в тепловой денатурации белков. Наиболее быстрая коагуляция наблюдается в изоэлектрической точке (для большинства белков это слабокислый раствор). В нейтральных и сильнокислых растворах осаждение таких белков происходит значительно хуже, а при высоком значении рН вовсе не наблюдается (исключение – оснóвные белки). Добавление к раствору белка нейтральных солей облегчает и ускоряет коагуляцию белков при нагревании вследствие дегидратирования белковых молекул.

Осаждение белков

В растворе молекулы белка вступают во взаимодействие со многими соединениями (кислотами, ионами металлов, спиртами и так далее), а также конкурируют с ними и друг с другом за молекулы растворителя (воды). Во многих случаях результатом этих процессов является выпадение белков в осадок. Осадки белков можно получить путем обратимого или необратимого осаждения, изменяя параметры факторов, стабилизирующих молекулы белка (температуру, заряд молекулы, величину гидратной оболочки и др.).

Концентрированные минеральные кислоты (кроме H₃PO₄) вызывают необратимое осаждение белков из растворов, что связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка. Избыток минеральной кислоты, за исключением азотной, растворяет выпавший осадок белка, полностью разрушая, «сжигая» белок. Поэтому за осаждением белка при использовании HCl и H₂SO₄ наблюдают на границе раздела фаз между белковым раствором и кислотой, где химическое воздействие последней минимально. Азотная кислота не разрушает белки, а модифицирует их, поэтому при ее избытке осадок сохраняется и приобретает характерный для нитросоединений желтый цвет.

Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами, однако разные органические кислоты неодинаково действуют на белок. Трихлоруксусная (ТХУ) и сульфосалициловая кислоты являются очень чувствительными и специфическими реагентами на белок и, поэтому, находят широкое применение в биохимических лабораториях. ТХУ часто применяется для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови). При этом продукты их распада остаются в растворе. Это особенно важно в тех случаях, когда нужно отдельно определить азот белка и азот низкомолекулярных соединений: аминокислот, мочевины и др. (так называемый «небелковый азот»). После осаждения белка ТХУ легко удаляется из фильтрата при кипячении, поскольку она разлагается с образованием летучих соединений – хлороформа и угольного ангидрида.

Многие органические растворители осаждают белки из нейтрального или слабокислого раствора. При добавлении к водному раствору белка определенной концентрации спирта или ацетона (осаждающие концентрации растворителей различны для разных белков) происходит выпадение белка в осадок. Осаждающее действие этих растворителей определяется дегидратацией молекул белка, что ведет к снижению их устойчивости в растворе. Если процесс осаждения проводить на холоду и полученный осадок быстро отделить от растворителя, то белок может быть снова переведен в раствор в водной фазе. Осаждение белков происходит при использовании некоторых других органических растворителей, например, фенола или формалина. Действие последних вызывает денатурацию белка вследствие дестабилизации водородных связей в молекуле полипептида.

Соли тяжелых металлов (Hg⁺², Ag⁺, Cu⁺², Pb⁺² и др.) вызывают необратимое осаждение белков за счет образования с ними нерастворимых в воде комплексов. В этом случае восстановление исходных свойств белков невозможно даже после удаления солей диализом или в результате сильного разбавления системы водой. Поэтому белки часто применяют в качестве противоядия при отравлении, например, солями ртути (сулема). Тем не менее, некоторые из таких осадков (при действии солей меди, свинца, цинка) растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции ионов металлов на поверхности белковых частиц: в результате этого белковые молекулы приобретают заряд и вновь переходят в раствор. Растворение осадков денатурированных белков при избытке солей тяжелых металлов называется адсорбционной пептизацией.

Растворы белков могут образовывать осадки при добавлении, так называемых алкалоидных реагентов. К последним относят таннин, пикриновую кислоту, некоторые другие вещества. Они представляют собой азотистые основания, содержащие различные гетероциклы с атомами азота. Способность белков осаждаться алкалоидными реагентами объясняется наличием сходных азотистых группировок в белках (имидазольные, пирролидиновые и др.) и в алкалоидах. Механизм осаждения белков алкалоидами заключается в образовании нерастворимых солеобразных соединений с оснóвными азотистыми группами. В таких комплексах белок выступает в роли катиона, алкалоид – аниона. Поэтому осаждение белков алкалоидами проводят в кислой среде (в этом случае молекулы белка перезаряжаются и переходят в состояние катионов). В щелочной среде осадки растворяются. Протамины и гистоны осаждаются в нейтральной среде.

Высаливание белков

Процесс высаливания основан на способности ионов солей связываться с коллоидными частицами белка и нейтрализовывать их заряд. Также важным фактором является разрушение гидратной оболочки белков. Из-за различий в зарядах и размерах разные белки осаждаются разными концентрациями солей. Например, глобулины имеют большую молекулярную массу и осаждаются 50% (NH₄)₂SO₄, а альбумины – 100% (NH₄)₂SO₄ (см. раздел «Ход работы»). Сульфат аммония обладает резко выраженной высаливающей способностью и осаждает белки, как в нейтральной, так и в слабокислой среде. Другие соли, например, хлорид натрия или сульфат магния, вызывают полное осаждение белков только при подкислении раствора. Высаливание белков является обратимым процессом. При уменьшении концентрации соли в растворе (например, при добавлении воды) происходит растворение выпавшего осадка белка.

Контрольные вопросы

1. Системы классификации белков

2. Белки: основной принцип строения.

3. Функции белков.

4. Уровни структурной организации белка. Надмолекулярные белковые комплексы.

5. Физико-химические свойства белков. Денатурация, осаждение и высаливание белков.

Литература

1. Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, «Просвещение», М., 1987.

2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993.

3. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996.

4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998.

5. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

6. Ленинджер А., Основы биохимии, т.1, «Мир», М., 1985.

7. Чиркин А.А., Практикум по биохимии, «Новое знание», Минск, 2002.

8. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д., Биологическая химия, «Бином», М., 2008.

9. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, «ОКФА», Одесса, 1994.

Дополнительная литература

4. Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2004.

5. Metzler D., Biochemistry, (The chemical reactions in living cells), Elsevier, Academic Press, V. 1-2, 2003-2004.

6. Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006.

Ход работы

Цель работы:	Изучение физико-химических свойств белков: определение изоэлектрических точек казеина и желатина; овладение методом фракционного разделения белков высаливанием.
Задание I	Определить изоэлектрические точки белков.

Определение изоэлектрической точки желатина по минимуму набухания

1. В три пробирки вносят по 0.2 г порошка желатина.

2. В первую пробирку наливают 1 мл буферного раствора с рН 1.0, во вторую – с рН 4.7, а в третью – с рН 9.0.

3. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют на 1 ч.

4. Затем определяют высоту геля в пробирках.

5. Зарисовывают результаты, делают вывод о численном значении изоэлектрической точки желатина.

Определение изоэлектрической точки желатина по мутности (по коагуляции)

1. В три пробирки наливают по 0.5 мл буферных растворов с рН 3.7, 4.7, 5.7.

2. Затем в пробирки добавляют по 0.5 мл 0.5% раствора желатина.

3. Далее во все пробирки приливают по 1 мл этилового спирта.

4. Наблюдают коагуляцию желатина (образование мутности) в одной из пробирок.

5. Записывают и объясняют результаты.

Определение изоэлектрической точки казеина по мутности (по коагуляции)

1. В три пробирки наливают по 1 мл буферных растворов с рН 3.7, 4.7, 5.7.

2. Затем в пробирки добавляют по 1 мл золя казеина.

3. Через 10 мин наблюдают максимальную коагуляцию казеина (наибольшее помутнение) в одной из пробирок.

4. Сравнивают полученные результаты с изоэлектрической точкой желатина.

5. Делают вывод о факторах, обеспечивающих устойчивость казеина.

Задание II

Изучение реакций осаждения белков в присутствии органических и неорганических соединений

Осаждение белков при нагревании

1. В пять пробирок наливают по 2 мл 1% раствора яичного белка.

2. Содержимое 1-ой пробирки нагревают.

3. Во 2-ую пробирку добавляют каплю 1% CH₃COOH и нагревают.

4. В 3-ю пробирку добавляют 0,5 мл 10% CH₃COOH и нагревают.

5. В 4-ую пробирку добавляют 0,5 мл 10% CH₃COOH, несколько капель насыщенного раствора NaCl и нагревают.

6. В 5-ую пробирку добавляют 0,5 мл 10% раствора NaOH и нагревают.

7. Наблюдают, записывают и объясняют результаты.

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

1. В три сухие пробирки наливают по 2 мл концентрированных азотной, соляной и серной кислот.

2. Наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке приливают в нее по 0,5 мл 1% раствора яичного белка так, чтобы он не смешивался с кислотой.

3. Наблюдают появление белого аморфного осадка на границе двух жидкостей.

4. Все пробирки встряхивают.

5. Наблюдают, записывают и объясняют результаты.

Осаждение белков органическими кислотами

1. В пробирку наливают 2 мл раствора белка и добавляют несколько капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

2. Наблюдают, записывают и объясняют результат.

Осаждение белков спиртом

1. В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют 2 мл C₂H₅OH и взбалтывают.

2. Наблюдают, записывают и объясняют результат.

Осаждение белков ацетоном

1. В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют осторожно по стенке пробирки 0.5 мл ацетона.

2. Наблюдают, записывают и объясняют результат.

Осаждение белков фенолом и формалином

1. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка.

2. Далее в первую пробирку добавляют 1 мл насыщенного водного раствора фенола, а во вторую – 1 мл формалина.

3. Наблюдают, записывают и объясняют результаты.

Осаждение белков солями тяжелых металлов

1. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка.

2. Далее в первую пробирку медленно, по каплям при встряхивании добавляют раствор сульфата меди, а во вторую – раствор ацетата свинца.

3. Наблюдают появление осадков.

4. Затем в каждую пробирку добавляют соответствующий раствор в избытке.

5. Наблюдают, записывают и объясняют результаты.

Осаждение белков реактивами на алкалоиды

1. В три пробирки наливают по 1 мл раствора белка.

2. Растворы подкисляют 2 каплями 1% раствора уксусной кислоты (в каждую пробирку).

3. В первую пробирку добавляют 5 капли насыщенного раствора пикриновой кислоты.

4. Во вторую – 5 капли 10% раствора таннина.

5. В третью – 3 капли 5% раствора HCl, а затем 5 капель 5% раствора гексацианоферрата калия, взбалтывая после добавления каждой капли.

Задание III

Фракционирование альбуминов и глобулинов яичного белка методом дифференциального высаливания

Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка с использованием сульфата аммония

1. К 1 мл неразбавленного яичного белка приливают 6 мл воды.

2. Для растворения образовавшегося небольшого белого хлопьевидного осадка глобулинов в эту пробирку приливают несколько капель насыщенного раствора сульфата аммония.

3. К 7 мл данного раствора яичного белка, приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония.

4. Наблюдают выпадение осадка глобулинов, который удаляют фильтрованием.

5. К фильтрату добавляют кристаллический сульфат аммония до полного насыщения.

6. Выпавший при этом осадок альбуминов также отфильтровывают.

7. С фильтратом проделывают пробу на полноту осаждения белка с помощью 5% ТХУ.

Обратимость высаливания

1. К 2 мл 1% раствора белка приливают 2 мл насыщенного раствора сульфата аммония.

2. Далее в пробирку наливают 4 мл воды и встряхивают.

3. Наблюдают, записывают и объясняют результаты.

Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка с использованием хлористого натрия и сернокислого магния

1. В две пробирки наливают по 3 мл белка.

2. Прибавляют до полного насыщения в одну пробирку тонко измельченный NaCl, в другую – MgSO₄.

3. Отфильтровывают появившиеся через несколько минут осадки глобулинов.

4. К фильтратам прибавляют по 5 капель 1% раствора уксусной кислоты.

5. Наблюдают выпадение альбуминов, отфильтровывают осадок.

6. Фильтрат проверяют на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические материалы к лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты.

4. Сделать выводы.