Выделение казеина

Наиболее доступным для изучения фосфопротеидом является белок молока – казеин. Вследствие присутствия фосфатной группы он обладает кислыми свойствами и в молоке находится в виде кислой кальциевой соли. Чаще всего казеин выделяют путем подкисления молока. Эта процедура основана на том, что казеин является гидрофобным белком, лишенным гидратной оболочки, поэтому в изоэлектрической точке (слабокислая среда) он становится крайне нестабильным и выпадает в осадок (см. лабораторную работу №2).

Определение фосфорной кислоты в казеине

Обнаружение фосфорной кислоты в белках, в том числе в составе казеина можно осуществить с использованием молибдата аммония или магнезиальной смеси.

Фосфорная кислота образует с молибденовым реактивом желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония:

H₃PO₄ + 12 (NH₄)₂MoO₄ + 21 HNO₃ → (NH₄)₃PO₄·12MoO₃ +

+ 21 NH₄NO₃ + 12 H₂O.

Реакция с магнезиальной смесью основана на образовании кристаллического осадка фосфата магний-амония MgNH₄PO₄ в ходе двух последовательных реакций: образования фосфата аммония и взаимодействия данной соли со смесью хлорида магния и хлорида аммония.

Гемопротеиды

Гемсодержащие белки участвуют в процессах транспорта электронов, транспорта кислорода, фотосинтеза. Классическими представителями сложных белков этой группы являются миоглобин и гемоглобин. На примере этих гемопротеидов можно четко проследить связь между структурой и функцией глобулярных белков. Данные гемопротеиды содержат в качестве простетической группы гем – циклический тетрапиррол, включающий атом железа, присутствие которого объясняет красный цвет данных белков и их способность запасать кислород (миоглобин) или обеспечивать его транспорт (гемоглобин). Тетрапирролы состоят из четырех молекул пиррола (рис. 3.1), связанных между собой четырьмя -метиновыми мостиками, что обеспечивает образование плоской (планарной) кольцевой структуры, несущей в определенных положениях соответствующие заместители.

Рис. 3.1 Структурная формула пиррола.

В тетрапиррольных структурах могут присутствовать разные -заместители представленные метильными (М), винильными (V) и пропионатными (Pr) группами. Например, в составе гема указанные заместители расположены в следующем порядке: M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (рис. 3.2).

Рис. 3.2. Структура гема.

В центре плоского тетрапиррольного кольца находится один атом железа в ферро-(Fe²⁺)-состоянии. Похожие по строению простетические группы, содержащие ионы металлов, обнаруживают и в других белках: цитохромах, хлорофилл-содержащих белках (Mg²⁺) и некоторых ферментах, например, каталазе, триптофанпирролазе и других. В цитохромах происходит циклическое окисление и восстановление атома железа (Fe²⁺ ↔ Fe³⁺), играющее определяющую роль в их функционировании. Напротив, окисление Fe²⁺ до Fe³⁺ в миоглобине или гемоглобине сопровождается потерей их биологической активности.

Миоглобин

Миоглобин, содержащийся в клетках скелетных мышц, запасает кислород в связанном состоянии и способствует его передаче в митохондрии, которые в процессе окисления поступающих в клетку питательных веществ кислород потребляют и генерируют АТР необходимый для мышечного сокращения. Миоглобин в пять раз быстрее, чем гемоглобин связывает кислород (другими словами имеет более высокое сродство к кислороду, чем гемоглобин).

Миоглобин состоит из единичной полипептидной цепи, состоящей из 153 аминокислотных остатков и одной гемо-группы (рис. 3.3). В результате проведенного рентгеноструктурного анализа было сделано несколько важных выводов относительно организации молекулы этого гемопротеида:

1. 75% полипептидной цепи находится в конформации -спирали (все -спирализованные участки являются правозакрученными). Обнаружено 8 основных участков спирализации, которые обозначены первыми буквами латинского алфавита: А, B, C, D, E, F, G и H. Спирализованные участки разделены 5 неспирализованными участками; такие же неспирализован-ные области находятся на концах цепи.

2. Молекула миоглобина настолько компактна, что внутри нее может уместиться всего четыре молекулы воды.

3. Все полярные радикалы, за исключением двух (два остатка гистидина принимают участие в связывании кислорода), расположены на внешней поверхности молекулы.

4. Большая часть гидрофобных радикалов расположена внутри молекулы миоглобина и таким образом защищены от соприкосновения с водой.

5. Каждый из четырех остатков пролина в молекуле миоглобина находится в месте изгиба полипептидной цепи. В других местах изгиба или поворотацепи расположены остатки серина, треонина и аспарагина.

Рис. 3.3. Пространственная модель молекулы миоглобина