Обладнання, прилади, матеріали

Пробірки, піпетки, культура E.coli, дистильована вода, засіб для миття посуду (50%), водяна баня, лід, скляні палички й скляні лопатки.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи

1. Внесіть 3 мл дистильованої води в пробірку. Використовуючи скляну лопатку, перенесіть клітини E. сoli (1/2 чашки Петрі на бригаду) в пробірку з дистильованою водою, перемішайте.

2. Додайте 3 мл миючого засобу в суспензію E. сoli. Перемішайте вміст пробірки.

3. Витримайте кожну пробірку у водяній бані протягом 15 хв. Температура водяної бані має бути вище 60 °C, однак нижче 70 °C.

4. Охолодіть пробірки в крижаній бані до кімнатної температури.

5. Наступний етап – осадження ДНК за допомогою розчинника. Обережно (по стінці пробірки) внесіть піпеткою 3 мл холодного етанолу (він має бути охолоджений у морозильній камері) поверх суспензії миючого засобу та E. сoli. Не перемішувати. Будьте обережні). Водорозчинна ДНК – нерозчинна в спирті й тому осаджується, коли вступає в контакт з ним.

Опрацювання результатів

Обережно внесіть чисту скляну паличку крізь спирт у суспензію, павутиноподібна маса стане видимою. Ця маса – осаджена ДНК. Паличка вносить невелику кількість спирту в суспензію, осаджуючи та прикріпляючи ДНК. Не перемішуйте повністю 2 шари.

Аналіз результатів

Студенти відповідно для завдання повинні оформити протоколи лаброраторної роботи.

Контрольні запитання і завдання

1. Визначте різницю понять „ядро” та „нуклеоїд”.

2. Охарактеризуйте основні етапи виділення ДНК з бактеріальних клітин.

3. Опишіть методи руйнування клітинної стінки бактерій.

4. Яке значення мають етапи додавання детергенту та етанолу в методиці виділення бактеріальної ДНК?

5. Визначте додаткові етапи виділення ДНК з клітин еукаріот, порівняно з методикою виділення ДНК з клітин прокаріот.

Література: [].

Модуль 2. Особливості культивування мікроорганізмів із заданими властивостями

Лабораторна робота № 2.1

Контроль мікроорганізмів фізичними агентами

Мета роботи – вивчити основні фактори навколишнього середовища, які пагубно діють на мікроорганізми.

Основні завдання роботи

1. Дослідити вплив осмотичного тиску на мікроорганізми.

2. Дослідити вплив УФ–променів на ріст мікроорганізмів.

Основні теоретичні відомості

Умови довкілля мають важливе значення для життєдіяльності мікроорганізмів. Серед факторів, які впливають на життєдіяльність мікроорганізмів, виділяють фізичні (вологість, температура, концентрація розчинених речовин, світло та інші форми променевої енергії, радіохвилі, ультразвук тощо), хімічні (рН, наявність токсичних речовин, вміст кисню) та біологічні (різного типу взаємозв’язки та взаємовідносини між мікроорганізмами та системами довкілля).

Фізичні фактори

Температура: життєдіяльність кожного мікроорганізму обмежена певними температурними межами.

Мінімальна (min) температура – нижче якої розмноження припиняється, оптимальна (opt) температура – найкраща температура для росту й розвитку мікроорганізмів і максимальна (max) температура – температура, при якій ріст клітин або вповільнюється, або припиняється зовсім.

Оптимальна температура, зазвичай, прирівнюється до температури навколишнього середовища.

Всі мікроорганізми стосовно температури умовно можна розділити на 3 групи (таб. 3):

Таблиця 3

Розподіл мікроорганізмів за впливом на них температури

Група мікроорганізмів		Температура, °С
		мінімум	оптимум	максимум
Психрофіли	облігатні	0 і нижче	5–15	20–22
	факультативні	0	25–30	30–35
Мезофіли		10–15	30–45	35–47
Термофіли		40–45	55–75	60–105

Перша група: психрофіли – це мікроорганізми, що ростуть при низьких температурах. До таких мікроорганізмів відносяться мешканці північних морів і водойм. До дії низьких температур багато мікроорганізмів дуже стійкі. Наприклад, холерний вібріон довго може зберігатися в льоді, не втративши при цьому своїй життєздатності. Деякі мікроорганізми витримують температуру до –190°С, а спори бактерій здатні витримувати до –250°С. Дія низьких температур припиняє гнильні й бродильні процеси. При низьких температурах мікроорганізми впадають у стан анабіозу, при якому вповільнюються всі процеси життєдіяльності, що протікають у клітині.

До другої групи відносяться мезофіли – це найбільш велика група бактерій.

До третьої групи відносяться термофіли – ці мікроорганізми живуть у гарячих джерелах. Серед термофілів зустрічається багато спорових форм. Спори бактерій набагато стійкіше до високих температур, ніж вегетативні форми бактерій. Наприклад, спори бацил сибірської виразки витримують кип’ятіння протягом 10–20 с. Всі мікроорганізми, включаючи й спорові, гинуть при температурі 165–170°С протягом години. Дію високих температур на мікроорганізми покладено в основу стерилізації.

Висушування. Для нормальної життєдіяльності мікроорганізмів потрібна вода. Висушування приводить до зневоднення цитоплазми, порушується цілісність цитоплазматичної мембрани, що веде до загибелі клітини. Деякі мікроорганізми під впливом висушування гинуть уже через кілька хв : це менінгококи, гонококи. Більше стійкими до висушування є збудники туберкульозу, які можуть зберігати свою життєздатність до 9 місяців, а також капсульні форми бактерій. Особливо стійкими до висушування є спори. Наприклад, спори цвілевих грибів можуть зберігати здатність до проростання протягом 20 років, а спори сибірської виразки можуть зберігатися в ґрунті до 100 років.

Для зберігання мікроорганізмів і виготовлення лікарських препаратів з бактерій застосовується метод ліофільної сушки. Сутність методу полягає в тому, що мікроорганізми спочатку заморожують при –273 °С, а потім висушують в умовах вакууму. При цьому мікробні клітини переходять у стан анабіозу й зберігають свої біологічні властивості протягом декількох років. Таким способом, наприклад, виготовляють біопрепарат «Колібактерин», що містить штами Е. coli.

Промениста енергія. У природі бактеріальні клітини постійно піддаються впливу сонячної радіації. Прямі сонячні промені пагубно діють на мікроорганізми. Це відноситься до ультрафіолетового спектра сонячного світла ( УФ–промені), вони інактивують ферменти клітини й руйнують ДНК. Патогенні бактерії більш чутливі до дії УФ–променів, ніж сапрофіти. Тому в бактеріологічній лабораторії мікроорганізми вирощують і зберігають у темряві.

Бактерицидну дію УФ–променів використовують для стерилізації закритих приміщень. Для цього використовуються бактерицидні лампи ультрафіолетового випромінювання з довжиною хвилі 200–400 нм.

На мікроорганізми впливають і інші види променистої енергії – це рентгенівське випромінювання, α–, β– і γ–промені пагубно впливають на мікроорганізми тільки в великих дозах. Ці промені руйнують ядерну структуру клітини. В останні роки радіаційним методом стерилізують вироби для одноразового використання – шприци, шовний матеріал, чашки Петрі.

Малі дози випромінювань, навпаки, можуть стимулювати ріст мікроорганізмів.

Під дією ультразвуку усередині клітини виникає дуже високий тиск. Це призводить до розриву клітинної стінки й загибелі клітини. Ультразвук використовують для стерилізації продуктів: молока, фруктових соків.

Високий тиск. До атмосферного тиску бактерії, а особливо спори, дуже стійкі. У природі зустрічаються бактерії, які живуть у морях і океанах на глибині 1000– 10 000 м під тиском від 100 до 900 атм. Дія підвищеної температури і підвищеного тиску використовується в парових стерилізаторах для стерилізації пором під тиском.

Осмотичний тиск. Величина осмотичного тиску визначається концентрацією розчинених речовин у середовищі. Середовища мають бути ізотонічними для мікробної клітини, тобто осмотичний тиск у середовищі має бути таким, як усередині клітини.

Більшість бактерій можуть рости на середовищах з 0,1 – 10 % NaCl. Цитоплазматична мембрана бактеріальної клітини регулює проникнення й вихід з неї води й розчинення речовин, зберігаючи при цьому осмотичну рівновагу. Надходження води з довкілля в клітину можливе лише в тому випадку, коли осмотичний тиск у клітині буде вищим, ніж тиск у зовнішньому розчині. При високому осмотичному тиску в середовищі клітина втрачає здатність поглинати з нього воду.

Нормальний тиск у клітині – від 3 до 7 атм.

Мікроорганізми, які добре розвиваються при нормальному тиску, називаються осмотолерантні; при підвищеному тиску – осмофільні.

Мікроорганізми, які вимагають підвищених концентрацій солей (зокрема КСl) називаються галофіти.

Гідростатичний тиск. На морських глибинах мікроорганізми витримують гідростатичний тиск, зумовлений масою стовпа рідини. Він може досягати значних величин, збільшуючись з кожними 100 м глибини на 1 МПа. Мікроорганізми, які пристосувались до високого гідростатичного тиску називаються баротолерантними.