Обладнання, прилади і матеріали

Мікроскопи, лічильні камери Горяєва – Тома, піпетки; предметні та покривні скельця; скляні палички; спиртівки, стерильні поживні середовища, чашки Петрі, стерильні пробірки, піпетки, стерильна вода.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи

1. Приготувати 0,1%–ну суспензію пресованих дріжджів. Відважити 0,1 г дріжджів. Ретельно розтерти наважку в ступці з 1–2 мл водопровідної води в рідку кашку й злити її в мірну колбу об’ємом 100 мл. Ступку промити водою, яку злити в ту ж колбу. Вміст колби довести водопровідною водою до мітки.

2. Одержану суспензію збовтувати протягом 5 хв.

3. Підрахувати кількість дріжджових клітин в суспензії, використовуючи камеру Горяєва (або Бюркера).

4. Визначити концентрацію клітин на денситометрі.

5. Визначити кількість клітин посівом на тверде поживне середовище.

Опрацювання результатів

На наступному занятті проаналізувати ріст мікроорганізмів на чашках Петрі.

Аналіз одержаних результатів

Студенти відповідно до завданя повинні підрахувати кількість колоній мікроорганізмів, що виросли на чашках Петрі. Порівняти результати різних методів визначення концентрації мікроорганізмів. Зробити висновки та оформити протокол лабораторної роботи.

Контрольні запитання і завдання

1. Порівняйте різні методи визначення кількості мікроорганізмів.

2. Опишіть принцип роботи денситометра.

3. Охарактеризуйте будову камери Горяєва та принцип роботи з нею.

4. Опишіть головні етапи визначення кількості мікроорганізмів методом серійних розведень.

5. Охарактеризуйте принцип роботи турбідостата.

Література: [].

Лабораторна робота № 1.2

Методи одержання та зберігання чистих та елективних

культур мікроорганізмів.

Мета роботи – засвоїти методи культивування і виділення чистих культур аеробних мікроорганізмів.

Основні завдання роботи

1. Ознайомитися та засвоїти методи одержання та зберігання чистих та елективних культур мікроорганізмів.

2. Опрацювати різні методи виділення чиcтих культур.

Основні теоретичні відомості

Вирощування мікроорганізмів на поживних середовищах називається культивуванням (lat. сultus – вирощування), а вирощені мікроорганізми – культурою. При вирощуванні мікроорганізмів у рідкому середовищі культури утворюють суспензії, осад або плівку, при вирощуванні на твердому середовищі – колонії.

Внесення клітин мікроорганізмів чи іншого дослідного матеріалу (зразки грунту, проби води) в стерильне поживне середовище для отримання накопичувальної культури називається посівом. Перенесення вже вирощених клітин з одного середовища до іншого (стерильного) називається пересівом. Культивування мікроорганізмів за певної температури називають інкубуванням (лат. іncubatio – вирощування за штучно створеної температури).

Вирощують мікроорганізми у скляному посуді: пробірках, колбах, чашках Петрі. В пробірках мікроорганізми культивують як в рідких, так і на твердих середовищах. Для вирощування аеробних культур пробірки зазвичай заповнюють рідким середовищем на 1/3, для анаеробних – на 2/3 об’єму. Для приготування твердого середовища пробірки заповнюють середовищем на 1/3–1/4 об’єму. Після стерилізації пробірки з незастиглим середовищем, яке містить агар, розташовують під невеликим кутом для отримання скошеної поверхні. Це так звані скошені середовища. Тверде середовище, яке застигло при вертикальному положенні пробірки, називають стовпчиком. Мікроорганізми в колбах культивують переважно в рідких поживних середовищах. В чашках Петрі мікроорганізми вирощують тільки на твердих середовищах. Для роботи з мікроорганізмами використовують спеціальні бактеріологічні голки, петлі, шпателі, які виготовляють з платинового дроту або ніхрому.

Посів або пересів мікроорганізмів здійснюють поблизу відкритого полум’я. При цьому пробірки необхідно тримати в нахиленому положенні, шоб гарантувати стерильність. Якщо ж їх тримати у вертикальному положенні, то можливе потрапляння сторонніх мікроорганізмів. Пробірки беруть у ліву руку. Правою тримають мікробіологічну петлю, ретельно її обпалюють, виймають корки з пробірок, обпалюють краї пробірок і здійснюють пересів. Перед тим, як закрити пробірки, корки обпалюють у полум’ї.

При тривалому зберіганні мікроорганізмів у лабораторних умовах може відбутися зміна певних фізіолого–біохімічних чи морфологічних характеристик. Тому необхідно здійснювати пересів культур на свіжі середовища з певною частотою залежно від виду, середовища, умов культивування. При такому зберіганні не можна допускати пересихання середовища. Існують й інші способи зберігання культур: під шаром стерильного вазелінового масла, в рідкому азоті, в ліофілізованому стані тощо.

Чистою культурою мікробів називають популяцію мікроорганізмів одного виду, отриману з ізольованої мікробної колонії. Під мікробною колонією мається на увазі потомство мікроорганізму, що виникає в результаті розмноження однієї мікробної клітини.

Виділення чистої культури мікробів є обов’язковим етапом бактеріологічного дослідження. Чиста культура необхідна для вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних властивостей, за сукупністю яких визначається видова приналежність досліджуваного мікроорганізму.

Для виділення чистих культур мікробів з матеріалів, що містять змішану мікрофлору, запропоновано багато різних методів. Найбільш поширеним є метод механічного роз’єднання мікроорганізмів, що перебувають у досліджуваному матеріалі, з метою одержання ізольованих колоній на поверхні або в глибині поживного середовища.

Широко застосовуються елективні поживні середовища, які стимулють розвиток тих мікроорганізмів, чисту культуру яких передбачається виділити.

Деякі види мікробів мають високу чутливість до впливу певних факторів зовнішнього середовища. Індивідуальна стійкість мікробів до того або іншого фактору була використана для розробки методів виділення чистих культур шляхом «вбивання» супутньої мікрофлори.

Для виділення бактерій у вигляді чистих культур відомо порівняно мало методів. Найчастіше це роблять шляхом ізолювання окремих клітин на твердому поживному середовищі, використовуючи метод посіву штрихом або розливу по чашках невеликої кількості рідкої культури. Однак отримання окремої колонії не завжди гарантує чистоту культури, оскільки колонії можуть вирости не тільки з окремих клітин, але з їхніх скупчень. Якщо мікроорганізми утворюють слиз, то до неї часто прикріплюються сторонні форми. У випадку виділення штамів Bacillus або актиноміцетів контамінуючі мікроорганізми можуть бути «обплутані» ланцюжками клітин або, відповідно, гіфами цих мікробів. Для очищення переважно використовувати неселективне середовище, оскільки на ньому краще ростуть контамінуючі мікроорганізми і їх легше виявити. Але навіть на неселективному середовищі не слід дуже швидко відбирати колонії, оскільки за даний відрізок часу можуть не вирости контамінуючі бактерії, які ростуть повільно.