1.4. Визначення числа клітин мікроорганізмів висівом на поживні середовища

На відміну від підрахунку мікроорганізмів під мікроскопом цей метод дає можливість визначити тільки число життєздатних клітин у популяції. Оскільки середовищ, придатних для росту всіх мікроорганізмів, не існує, метод висіву дає можливість визначити число мікроорганізмів, здатних рости на середовищі даного складу, але не дозволяє врахувати ті мікроорганізми, які не ростуть або ростуть украй повільно. Це важливо пам’ятати при аналізі таких природних субстратів, як ґрунт, вода й т.п.

Визначення кількості клітин висівом на тверді поживні середовища (чашковий метод Коха). Метод широко застосовують для визначення чисельності життєздатних клітин у різних природних субстратах і в лабораторних культурах. У його основі лежить принцип Коха, відповідно до якого кожна колонія є потомством однієї клітини. Це дозволяє на підставі числа колоній, що виросли після посіву на тверде поживне середовище визначеного об’єму досліджуваної суспензії, судити про вихідний вміст у ній клітин мікроорганізмів. Результати кількісного обліку мікроорганізмів, проведеного методом Коха, часто виражають не в числі клітин, а в умовних одиницях – так званих колонієутворюючих одиницях (КУО).

10. Визначення числа мікроорганізмів цим методом включає три етапи: готування розведень, посів на тверде середовище в чашки Петрі й підрахунок колоній.

Г

Рис. 4 Схема готування розведень і посіву суспензії мікроорганізмів

отування розведень. Чисельність популяції мікроорганізмів зазвичай велика, тому для одержання ізольованих колоній необхідно приготувати ряд послідовних розведень (рис. 4). Розведення готовлять у стерильній водопровідній воді або 0,85% розчині NaCl (фізрозчині). У ході досліду доцільно використовувати той самий коефіцієнт розведення, наприклад 10, що зменшує ймовірність помилки.Для готування розведень стерильну водопровідну воду розливають по 9 мл у стерильні сухі пробірки. Потім 1 мл досліджуваної суспензії стерильною піпеткою переносять у пробірку з 9 мл стерильної води – це 1–ше розведення, 10^–1. Отримане розведення ретельно перемішують новою стерильною піпеткою, набираючи в піпетку й випускаючи з неї отриману суспензію. Цю процедуру виконують 3–5 разів, потім тією же піпеткою відбирають 1 мл отриманої суспензії й переносять в 2–гу пробірку – одержують 2–ге розведення (10^–2). У такий же спосіб готовлять і наступні розведення. Ступінь розве-дення залежить від густини досліджуваної популяції мікроорганізмів; відповідно вона тим більше, чим більше густина популяції.

Для кожного розведення необхідно обов’язково вико-ристовувати нову піпетку. Зневага цим правилом приводить до одержання помилкового результату.

Посів. Висівати суспензію можна поверхневим або глибинним способом. Перед посівом поверхневим способом (рис. 4) розливають розплавлене, найчастіше агаризоване, поживне середовище в ряд стерильних чашок Петрі по 15–20 мл у кожну. Чашки залишають на горизонтальній поверхні, поки середовище не застигне.

Після того як середовище готове, на його поверхню стерильною піпеткою наносять точно виміряний об’єм (0,05 або 0,1 мл) відповідного розведення й розподіляють його стерильним скляним шпателем по поверхні середовища. Висіви на тверде середовище проводять, як правило, із трьох останніх розведень, причому з кожного роблять 2–4 паралельних висіви. Посіви можна робити однією піпеткою, але при цьому починати треба обов’язково з більшого розведення. Для кожного розведення використовують новий стерильний шпатель. Після посіву чашки Петрі поміщають у термостат кришками донизу.

При глибинному посіві точно виміряний об’єм (як правило 0,1; 0,5 або 1,0 мл) вихідної суспензії або розведення вносять у розплавлене й охолоджене до 48–50° агаризоване середовище, ретельно перемішують і потім виливають у чашку Петрі Середовищу дають застигти. У випадку глибинного посіву використовують середовище, розлите в пробірки.

При більших масштабах роботи середовище по пробірках не розливають. По 1 мл з відповідного розведення переносять стерильною піпеткою в 2–4 стерильні чашки Петрі. Потім заливають чашки 15–20 мл розплавленим й охолодженим до 48–50° середовищем і ретельно змішують поживне середовище з посівним матеріалом легким обертовим рухом чашки по поверхні стола, після чого чашки залишають на горизонтальній поверхні до застигання. Коли середовище застигне, чашки Петрі поміщають у термостат кришкою донизу.

Підрахунок колоній. Колонії мікроорганізмів залежно від швидкості росту підраховують через 2–15 доби інкубації. Підрахунок, як правило, проводять, не відкриваючи чашок Петрі. Для зручності кожну колонію відзначають крапкою на зовнішній стороні дна чашки. При великій кількості колоній дно чашки Петрі поділяють на сектори, підраховують колонії в кожному секторі й підсумовують результати. Іноді для підрахунку колоній використовують спеціальні напівавтоматичні лічильники.

Кращим розведенням варто вважати те, при висіві з якого в чашці Петрі виростає від 30–50 до 100–150 колоній. Якщо число вирослих колоній виявилося менше 10, то ці результати для розрахунку кількості клітин у вихідному матеріалі не використовують. Результати паралельних висівів з того самого розведення сумують і визначають середнє число колоній, що виросло при висіві з розведення на одній чашці.

Кількість клітин в 1 мл досліджуваного субстрату обчислюють, по формулі (3):

(3)

де М – кількість клітин в 1 мл; а – середнє число колоній при висіві розведення, з якого зроблений висів; V – обсяг суспензії, узятий для посіву, у мл; 10ⁿ – коефіцієнт розведень.