Додаток: Ідентифікація бактерій

Мета роботи – дослідити та індентифікувати одну з запропонованих бактеріальних культур.

Основні завдання роботи

Посіяти запропоновану культуру на різні поживні середовища; на наступному занятті проаналізувати ріст мікроорганізму, дослідити та ідентифікувати його за запропонованою схемою (додаток 1); записати результати в протокол лабораторної роботи.

Основні теоретичні відомості

Ідентифікація має велике значення при діагностиці інфекційних захворювань, при дослідженні санітарно–гігієнічного стану|достатку| об’єктів навколишнього середовища|середи| (вода, повітря, ґрунт, продукти харчування).

Першим етапом ідентифікації є|з'являється| посів або пересівання бактерійної культури на різні типи|типів| поживного середовища, культивування та аналіз росту. Для подальшого дослідження необхідно приготувати препарат та мікроскопування, фарбування|забарвлювати|, культивування, і біохімічне дослідження.|середи|, культивуванннку

Дослідження .морфології клітинних|кліткових| структур

Клітинна стінка. Тонку структуру клітинної стінки добре видно лише в електронному мікроскопі. Для спостереження клітинної стінки в світловому мікроскопі застосовують метод темного поля або спеціальне фарбування, за допомогою якого вдається легко виявити межі між окремими клітинами, розташованими у вигляді довгих ниток або щільних агрегатів. На знежиреному склі роблять мазок клітин досліджуваних бактерій, висушують його на повітрі і фіксують протягом 5 хв 5% – ним розчином фосфоромолібденової кислоти. Потім препарат промивають водою і зафарбовують не більше 15 хв 0,02% – ним розчином кристалвіолету. Знову промивають водою, висушують і мікроскопують з іммерсійною системою. Клітинна стінка зафарбовуєтьсяв чорний колір, а цитоплазма – в блідобузковий.

Виявлення кислотостійкості. Кислотостійкість – властивість, характерна для деяких мікобактерій і нокардий. Вона полягає в збереженні фарбування клітинами цих бактерій при обробці їх кислотою. Найбільшого поширення набув спосіб виявлення кислотостійкості за Циль–Нільсеном. На знежиреному предметному склі готують два мазки: досліджуваних клітин і клітин кислотостійких мікобактерій. Препарат висушують на повітрі і фіксують над полум’ям пальники. Мазок накривають фільтрувальним папером, заливають препарат карболовим фуксином Циля і потім 2–3 рази підігрівають його до появи пари, тримаючи скло високо над полум’ям пальника. За появою пари спостерігають, дивлячись на мазок збоку, і при появі пари негайно відставляють препарат у бік. Після цього препарату дають охолонути, знімають фільтрувальний папір, зливають фарбник і мазок промивають водою. Потім препарат обезбарвлюють 5% – ним розчином Н₂SO₄. Для цього предметне скло занурюють 2–3 рази в стакан з кислотою, не затримуючи його в ній. Препарат знову ретельно промивають водою і дофарбовують 3–5 хв метиловим синім по Леффлеру. Фарбу зливають, препарат промивають водою, висушують і досліджують з іммерсійною системою. При строгому дотриманні режиму фарбування кислотостійкі набувають червоного кольору, тоді як кислотонестійкі – синього.

Нуклеоїд. Досить чітко нуклеоїд виявляється у наступних бактерій: Proteus vulgaris, Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium, chroococcum, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis. На предметному склі роблять мазок добової культури бактерій, висушують його на повітрі і фіксують протягом 2–3 хв у парі осмієвої кислоти. З цією метою на дно чашки Петрі наносять 2–3 краплі фіксатора, а предметне скло поміщають мазком униз на обрізане скло. Після закінчення фіксації препарат опускають на 2–3 хв в стаканчик з розчином 1 н HCl для гідролізу рибосомальной РНК. Стакан тримають на водяній бані при 60 °С. Після гідролізу препарат одразу промивають водою. Потім мазок поміщають на 15 хв в 1%–ный розчин формаліну, знов промивають водою і зафарбовують протягом 1–2 хв 0,1 – 1,0% – ним розчином основного фуксину. Препарат промивають, висушують і мікроскопують з іммерсійною системою. Цитоплазма зафарбовується в рожевий колір, нуклеоїд – в яскраво–малиновий.

Ендоспори. Ендоспори утворюють бактерії родів Bacillus, Clostridium і деяких інших. Для виявлення здатності клітин до спороутворення краще використовувати старі культури. Спори можна виявити при спостереженні живих клітин, а також шляхом диференціального фарбування цитоплазми і спори. У разі виявлення у мікроорганізму здібності до утворення спор необхідно звернути увагу на тип спороутворення (бацилярний, клостридіальний, плектридіальний), розташування спори в клітині (центральне, ексцентральне або полярне), форму вільних спор (кругла, овальна або довгаста) і визначити їх розміри. З цією метою досліджують клітини 2–3–добової культури, оскільки більшість спороутворюючих бактерій проходять за цей період часу всі стадії розвитку – від вегетативної клітини до вільної спори.

Дослідження спор в живих клітинах. Спори в порівнянні з цитоплазмою характеризуються вищим показником заломлення світла, тому при мікрокопіюванні в світлому полі їх видно як темніші включення округлої або овальної форми. При використанні фазово–контрастного пристрою спори мають вид світлих включень на фоні майже чорних клітин.

Метод виявлення спор негативним фарбуванням.

На предметному склі готують тонкий мазок клітин споруліруючих бактерій, підсушують на повітрі і фіксують в полум’ї. Потім на 3 – 5 хв наносять метиленовий синій або на 1 – 3 хв фуксин, після чого препарат обережно просушують на повітрі. Переглядають з іммерсією.

Вегетативні клітини бактерій фарбуються, а спори, що мають багатошарову, важкопрониклу оболонку, – ні. Їх видно|показний| як сильно заломлюючі світло сферичні або овальні утворення, що знаходяться|перебувають| залежно від стадії спороутворення всередині|всередині| або поза|зовні| клітинами|клітинами| бактерій.

Метод зручний при кількісній оцінці процесу спороутворення шляхом підрахунку кількості спор і вегетативних клітин|клітин| в різних умовах росту бактерій.

Диференціальне фарбування спор за методом Пешкова.

Спори і цитоплазму зафарбовують при нагріванні. Промивання препарату водою веде до знебварвлення цитоплазми, тоді як спора міцно утримує фарбник.

На знежиреному предметному склі готують мазок, висушують його на повітрі, фіксують в полум’ї пальника і заливають розчином метиленового синього по Леффлеру. Фарбник|барвник| доводять до кипіння, тримаючи предметне|предметне| скло над полум’ям пальника. По мірі випаровування фарбника|барвника| додають|добавляють| нові його порції. Тривалість фарбування|фарбування|, вважаючи|лічити| з моменту|із моменту| закипання фарбника|барвника|, – 10 – 20 с. Потім предметне|предметне| скло охолоджують, препарат ретельно промивають водою, після чого клітини протягом 30 с|із| дофарбовують 0,5% – ним| водним розчином нейтрального червоного або сафраніну. Фарбник|барвник| зливають, препарат промивають водою і мікроскопують з|із| іммерсійною системою. При правильному фарбуванні|пофарбуванні| клітини мають червоний колір|цвіт|, а спори – синій. Замість метиленового синього можна використовувати малахітовий зелений. В цьому випадку препарат, фіксований в полум’ї пальника, заливають на 7 – 10 хв 7,5% – ним| розчином малахітового зеленого. Фарбування|пофарбування| проводять з|із| підігрівом|підігріванням|, поміщаючи препарат над судиною|посудиною| з|із| киплячою водою або над полум’ям пальника. Після закінчення фарбування предметне|предметне| скло охолоджують, промивають препарат водою і дофарбовують клітини 0,25% – ним| водним розчином сафраніну протягом 1 –2 хв. Спори забарвлюються в зелений колір|цвіт|, клітини – в рожевий|трояндовий|.

Фарбування капсули. Ці структури часто мають консистенцію гелю і їх погано видно при мікроскопуванні живих клітин. Хімічний склад капсул у різних бактерій неоднаковий, тому їх не можна виявити яким–небудь одним методом фарбування. Крім того, капсули при фарбуванні легко деформуються, а речовина капсули слабо зв’язує фарбник, який легко відмивається в процесі обробки препарату. Найчастіше для виявлення капсул застосовують спосіб «негативного» фарбування (негативного контрастування) за допомогою рідкої туші. Для цього невелику кількість клітин з твердого середовища поміщають в краплю розбавленого фуксину, змішують з краплею туші, закривають покривним склом і мікроскопують з об’єктивом х40. На загальному темному фоні препарату добре видно безбарвні|безколірні| капсули, та інші клітини мікроорганізмів, пофарбованів рожевий колір.

Фарбування капсул за методом Гінса. На край предметного скла мікробіологічною петлею наносять краплю чорної туші, вносять до неї клітини, добре перемішують і ребром покривного скла роблять мазок по всій поверхні скла. Мазок висушують на повітрі і фіксують 5–10 хв сумішшю Никіфорова або 3 хв абсолютним метанолом. Далі мазок фарбують карболовим фуксином Циля, розведеним водою у співвідношенні 1:3. Час фарбування – 2 – 3 хв. Препарат промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують з іммерсійною системою. На темно–сірому фоні препарату контрастно виділяються рожево–малинові клітини бактерій, оточені безбарвними капсулами.

Фарбування за Грамом. Це фарбування є важливою діагностичною ознакою. За здатністю фарбуватися фарбниками триметилфенолового ряду всі бактерії діляться на дві групи: грампозитивні і грамнегативні. Грампозитивні бактерії утримують комплекс генціанфіолету з йодом при обробці препарату спиртом і тому забарвлюються у фіолетовий колір. Грамнегативні бактерії не мають такої властивості і знебарвлюються спиртом. При подальшій обробці фуксином або сафраніном вони набувають рожевого кольору.

Фарбування за Грамом полягає в наступному. На одному знежиреному склі роблять мазок різних мікроорганізмів: у центрі – мазок клітин досліджуваної культури, зліва і справа – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури мають бути грампозитивними (наприклад Micrococcus luteus або Bacillus cereus), інший – грамнегативними (наприклад Escherichia coli). Мазки слід готувати тонкими, щоб клітини рівномірно розподілялися по поверхні скла і не утворювали скупчень. Препарат висушують на повітрі, фіксують над полум’ям пальника і зафарбовуют протягом 1–2 хв генціанвіолетом. Потім фарбник зливають і, не промиваючи мазок водою, обробляють його 1–2 хв розчином Люголя до почорніння. Зливають розчин Люголя, препарат обезбарвлюють 0,1 – 1,0 хв 96%–ным етиловим спиртом, швидко промивають водою і додатково офарбовують 1–2 хв водним фуксином. Фарбник зливають, препарат промивають водою, висушують і мікроскопують з іммерсійною системою. При правильному фарбуванні грампозитивні бактерії мають синьо–фіолетовий колір, грамнегативні – рожево–червоний.

Експрес–метод визначення грам–типу мікроорганізмів. Метод заснований на руйнуванні клітин грамнегативних бактерій в лужному середовищі і визначенні вільної ДНК. Для цього на предметне скло наносять краплю 3%–ного розчину КОН і 1 петлю 24–годинної досліджуваної агарової культури, ретельно перемішують. При тестуванні грамнегативних культур через 5 – 7 с при русі петлі вгору утворюється слизистий слід завдовжки 1–2 см; якщо слиз не утворюється, то тестована культура грампозитивна.