Порядок і рекомендації щодо виконання роботи
1. Визначення активності антибіотиків методом серійних розведень в рідких середовищах|середі|
Приготувати розчин антибіотика ампіциліну з|із| концентрацією 128 мг/мл|;
Пронумерувати і підписати пробірки (таб.8);
Таблиця 8
Пробірка № |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
Концентрація антибіотика |
64 |
32 |
16 |
8 |
4 |
2 |
1 |
ріст|зріст| контроль |
стерильність контроль |
В кожну пробірку внести 0,5 мл м’ясо–пептонного бульону.
У
Рис. 9 Метод серійних розведень в рідких середовищах
1–шу| пробірку внести 0,5 мл| розчину ампіциліну (рис.9 (а)) (концентрація ампіциліну в цій пробірці – 64 мг/мл|);
|середі|
Стерильною піпеткою перемішати|перемішувати| вміст першої пробірки, відібрати 0,5 мл| і внести до другої пробірки (концентрація ампіциліну в цій пробірці – 32 мг/мл|);
Стерильною піпеткою перемішати|перемішувати| вміст другої пробірки, відібрати 0,5 мл| і внести до третьої пробірки (концентрація ампіциліну в цій пробірці – 16 мг/мл|);
Аналогічно продовжити до 7 пробірки включно. Стерильною піпеткою перемішайте|перемішуйте| вміст пробірки, відберіть 0,5 мл|, щоб|аби| у всіх пробірках був однаковий об’єм|обсяг|;
8–ма і 9–та пробірки – контроль, розчин антибіотика не додаємо;|добавляємо|
Приготувати суспензію культури E. coli. Показання денситометра – 0,5 (стандарт Мак–Фарланда);
З|із| цієї суспензії беруть 0,1 мл| і вносять до 9,9 мл| фізіологічного розчину|, отримуючи|одержувати| таким чином розведення в 100 разів.
Стерильною піпеткою перемішати|перемішувати| вміст пробірки і отриману суспензію вносять до пробірок (1–7) з|із| серійно розведенням антибіотиком| і в 8–у пробірку по 0,1 мл| (рис.9 (b);Акуратно перемішайте|перемішуйте| вміст пробірок і поставте в термостат на 18–20 годин.
2. Визначення бактерійної резистентності до хіміотерапевтичних речовин: мутація
Бактерійні мутації більші легко виявити, оскільки бактерії гаплоїдні; тобто, вони мають тільки одну непарну хромосому. Крім того, бактерії, швидко розмножуються (зазвичай 109 клітин в культуральній рідині за ніч) таким чином, можна сподіватись, що мутанти з’являються через короткий час.
Стрептоміцин – антимікробний агент, який, подібно до гентаміцину, інгібує синтез білка, діючи на бактерійну рибосому.
Матеріали: стерильні пробірки, що містять 19 мл поживного агару (перше заняття); стерильні пробірки, що містять 20 мл поживного агару (друге заняття); флакони, що містять 49 мл поживного бульйону; стерильні чашки Перті; розчин стрептоміцину (20 мг/мл); 18–24–годинна культура Escherichia coli; стерильні пробірки, піпетки 1–10 мл; 0,85% розчин NaCl.
Дослід
Протягом|впродовж| цього експерименту, вам доведеться швидко виконати|виконати| декілька етапів до застигання агару (рис.10)|тверднутиме|.
Залиште 3 пробірки з розтопленим|танути| поживним середовищем у водяній бані 50 °C.|
Візьміть 1 пробірку з МПА, 1 флакон, що містить 49 мл МПБ та чашку Петрі і підпишіть маркером «SM 100» (|із|тобто|цебто|, містить|із| 100 мг|із| стрептоміцину/мл|). Ще 1 пробірку з МПА, 1 флакон, що містить 49 мл МПБ та чашку Петрі підпишіть «SM 250» (|із|тобто|цебто|, містить|із| 250 мг|із| стрептоміцину/мл|). Третій варіант (1 пробірку з МПА, 1 флакон, що містить 49 мл МПБ та чашку Петрі) підпишіть маркером «контроль» (|із|бебез стрептоміцину|).
Рис. 10 Схема експерименту
Додайте|добавляйте| 0,1 мл| стрептоміцину до розплавленого середовища в пробірку з написом «SM 100» та 0,25 мл| стрептоміцину в пробірку з написом «SM 250».
Додайте 1 мл E. coli до кожної пробірки, що містить стрептоміцин і у контрольну пробірку без стрептоміцину. Добре перемішайте обертаючи кожну пробірку форми між долонями Ваших рук (не трусити) і швидко залийте у відповідну чашку Петрі. Залиште чашки до застигання середовища.
Додайте|добавляйте| 0,25 мл| стрептоміцину у флакон з написом «SM 100» та 0,6 мл| стрептоміцину у флакон з написом «SM 250».
Додайте 1 мл культури E. coli до кожного флакона із стрептоміцином і контрольного флакона без стрептоміцину.
Після того, як середовище|середа| в чашках застигне, заклейте чашки скотчем|. Поставте засіяні чашки і флакони в термостат на 35–37 °С.
На наступному|такому| занятті ви визначите|вирішите| чи з’явилися|виникли| колонії, стійкі до стрептоміцину (кроки|хода| 9 – 18).
Підпишіть дві пробірки з МПА «SM 100», ще дві пробірки – «SM 250» і наступні дві пробірки – «контроль» (немає стрептоміцину). Помістіть всі пробірки у водяній бані 50 °C.
Підпишіть шість чашок Петрі|страви| як вказано нижче|таким чином| (дивіться на рис.2): «агар SM 100», «агар SM 250», «агар–контроль», «МПБ SM 100», «МПБ SM 250», «МПБ–контроль» Поділіть маркером кожну з 6 чашок на три секції|перетини|. Підпишіть|маркіруйте| секції|перетини| кожної чашки як вказано нижче|таким чином|: «SM 100», «SM 250», «контроль».
До кожної з двох пробірок розтопленого|танути| агару (крок|хода| 9) з написом «SM 100», додають|добавляють| 0,1 мл| стрептоміцину. Поживне середовище з однієї пробірки перелийте в чашку Петрі з написом «агар SM 100», а з іншої пробірки – в чашку з написом «МПБ SM 100».
До кожної з двох пробірок розтопленого|танути| агару з написом «SM 250», додайте|добавляють| 0,25 мл| стрептоміцину і перелийте у відповідні чашки.
Перелийте поживне середовище з останніх двох пробірок без стрептоміцину у відповідних чашки Петрі|пластинках|. Залиште до застигання.
Розгляньте|іспитуйте| флакони і чашки|пластинки|, засіяні на попередньому занятті|сеансі|.
Запишіть спостереження у таблицю |графіку|.
З кожної чашки|пластинки|, на якій ви бачите ріст бактерій|приріст|, роблять водну суспензію (декілька колоній). Висіваємо на відповідну секцію кожної чашки |пластинки|з назвою “Агар.” Наприклад|за прикладом|, колонії, що виросли на чашці|пластинкою|, що містить|утримується| 100 мг |із|стрептоміцину/мл|, пересіваємо на три сектори кожної чашки з назвою “SM 100” |пластинці|.
Пересійте з кожного флакону |баклаг| на відповідні сектори чашок Петрі з назвою “МПБ.”
Заклейте всі чашки скотчем та поставте в термостат з температурою 35–37 °C|.
Роздивіться|іспитуйте| чашки на наступному занятті і запишіть результати у вигляді таблиці|графіку|.