Методи визначення активності антибіотиків

Визначення активності антибіотиків методом серійних розведень

Серійний метод розведень може бути виконаний в різних об’ємах|обсягах| середовища|середи| (від 1 до 10 мл|). Експерименти виконуються в асеп­тичних| умовах при використанні стерильних піпеток для кожного| інгредієнта реакції. Титрування можна проводити на твердих і рідких середовищах|середі|.

При титруванні в рідких середовищах в ряд пробірок наливають однаковий об’єм поживного середовища. Кількість пробірок визначається кількістю розведень препарату, яке необхідно взяти для досліду. У першу пробірку вносять певну кількість розчину антибіотика, перемішують, потім певний об’єм суміші з першої пробірки переносять в другу, перемішують і переносять ту ж кількість суміші з другої в третю і так далі З останньої пробірки, що містить антибіотик, такий же об’єм суміші виливають геть, щоб у всіх пробірках об’єм рідини був однаковий. Дві пробірки, що не містять антибіотика, є контрольними. Після цього у всі пробірки, що містять серійно розведений антибіотик, і в одну контрольну пробірку вносять однакову кількість суспензії тест–культури. Друга контрольна пробірка містить тільки поживне середовище. Штатив з пробірками струшують і ставлять в термостат при 37° на 18–20 годин.

Кратність розведення антибіотика зазвичай|звично| вибирають рівною двом, для цього в кожну пробірку наливають, наприклад, по 1 мл| бульйону, в першу пробірку вносять 1 мл| розчину антибіотика і переносять з|із| пробірки в пробірку по 1 мл| суміші. При цьому точність визначення активності препарату складає ± 50%. Точність визначення можна підвищити шляхом додаткових розведень| антибіотика, наприклад, використовуючи кратності 1:1,1; 1:1,15; 1:1,20 і так далі

Суспензії тест–мікроорганізмів готують на фізіологічному (0,85%) розчині NаСl| при обов’язковому порівнянні із|із| стандартом каламутності. При титруванні антибактеріальних антибіотиків концентрація мікроорганізмів зазвичай|звично| складає 1000 мікробних клітин|клітини| на 1 мл| розчину антибіотика в поживному|живлячому| бульйоні. Цього досягають наступним чином. Готують суспензію тест–мікроорганізму за стандартом 10 од|. каламутності, що складає 1 млрд. мікробних клітин в 1 мл. З|із| цієї суспензії беруть 0,1 мл| і вносять до 9,9 мл| фізіологічного розчину|, отримуючи|одержувати| таким чином розведення в 100 разів. Отриману|одержувати| суспензію таким же чином|так само| розводять ще в 100 раз, досягаючи кон­центрації| мікробних клітин 100000 в 1 мл. Цю суспензію розводять в 10 разів, додаючи 1 мл| її в 9 мл| фізіологічного розчину. Отриману суспензію вносять до пробірок з|із| серійно розведеним антибіоти­ком| по 0,1 мл| на 1 мл| поживного бульйону.

Метод серійних розведень на твердих середовищах відрізняється тим, що мікроби–забруднювачі легко виявляються і по суті не змінюють загальних результатів титрування, тоді як на рідких середовищах весь досвід може виявитися безрезультатним із–за попадання в пробірки хоч би одиничних клітин сторонніх стійких мікроорганізмів. Цей метод використовують також при роботі з мікроорганізмами, які не ростуть на звичайних рідких середовищах, наприклад, туберкульозна паличка, яку вирощують на середовищі, що містить згорнуту сироватку.

Спочатку готують ряд|лаву| серійних розведень антибіотика, а потім вносять по 1 мл| кожного розведення в пробірку, що містить|утримує| 4 мл| розплавленого і охолодженого до 45–50°| агаризованого середовища|середи|. Потім пробірки скошують до застигання агару, а на поверхню твердого середовища|середи| петлею засівають суспензію тест–мікроорганізму.

Для виявлення бактерицидної дії препарату роблять|чинять| посів на МПА з у|із|сіх пробірок, де візуально не відмічено ріст мікроорганізму. Для стійких антимікробних речовин, які абсор­буються| на мікробних клітинах|клітинах| і перешкоджають їх росту навіть в свіжому поживному середовищі|середі|, застосовують відповідні нейтралі­затори|.

Визначення активності антибіотиків методом дифузії в агар

Цей метод є більш точним, ніж метод серійних розведень, тому він частіше використовується на практиці.

Хід досліду. Голодний агар розливають по 15 мл в чашки Петрі, розміщені на горизонтальному столику. Після застигання агару чашки підсушують в термостаті, потім в кожну чашку наливають по 5 мл поживного агару, змішаного з тест–культурою. Кількість останньої беруть з розрахунку 20 млн. клітин на 1 мл середовища.

Перед внесенням культури до агару, його необхідно охолодити до 45–50°|. Замість циліндрів можна використовувати лунки, які роблять|чинять| агарі за допомогою спеціального пристосування. Після|потім| застигання другого шару агару на його поверхню наносять|завдають| по трафарету 6 циліндрів на кожну чашку. У 3 з|із| них через один вносять по 0,1 мл| стандартного розчину (контроль). Після|потім| цього чашки поміщають в термостат при 37°| на 16–18 годин. Після закінчення цього часу циліндри видаляють|знищують| з чашки, вимірюють|виміряють| розміри зон затримки росту|зросту| тест–мікроорганізмів. Середньоарифметична величина ді­аметра| зон не повинна мати відхилення більш ніж ± 1 мм.

Похибка дифузійного методу складає ± 5–15%.

Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом дисків.

Перевірка чутливості мікроорганізмів до антибіотиків необхі­дна| перш за все|передусім| для оцінки ефективності антибіотиків в клінічних| умовах. Клінічний матеріал або виділену чисту культуру засівають на поверхню поживного|живлячого| агару суцільним газоном. Потім стерильним пінцетом накладають на агар паперові диски, просочені розчином певного антибіотика. Чашки ставлять в термостат при 37 °С|СССна 16–18 годин, після чого відмічають результати. За наявності чутливої до антибіотика| флори навколо|навкруг| відповідних дисків буде зона відсутності рос­ту| мікроорганізмів (таб 7).

Таблиця 7

Співвідношення чутливості мікроорганізмів

до антибіотиків і діаметру зон їх пригнічення

Ступінь чутливості	Розмір діаметру зони пригноблення (мм)
Високочутливий Чутливий Малочутливий|нечутливий| Стійкий	26 та більше 15–25 11–14 10 або відсутність зони пригнічення

Прискорений метод визначення чутливості мікроорганізму до антибіотика.

У чашку Петрі наливають 15 мл поживного агару. Після застигання агару на нього наносять суміш що містить 4 мл такого ж агару, 1 мл суспензії тест–культури, приготованої за стандартом 1 млрд. клітин в 1 мл, і 1 мл 0,2% водного розчину 2,6–дихлорфеноліндофенола (рН 7,2–7,3). Замість культури можна використовувати клінічний матеріал. Потім на застиглий агар яскраво–синього кольору наносять диски, просочені антибіотиками, і чашки ставлять в термостат при 37°С. Через 2–4 години враховують результати по діаметру синіх зон відсутності росту. Резистентні до антибіотика мікроби відновлюють барвник, знебарвлюючи його або трансформуючи в жовтий колір.

Даний фарбник|барвник| затримує ріст|зріст| стафілококів, тому при роботі з|із| цим мікроорганізмом розчин індикатора наливають на поверхню чашки в кількості|у кількості| 2–3 мл| вже після|потім| витримування чашки з|із| дисками в термостаті. Надлишок індикатора зливають через 5–7 хв|мінути| і враховують результати.