6. Загальна характеристика спеціальних методів в біохімії.

Рівень розвитку науки залежить від методів дослідження. Деякі важливі біохімічні відкриття стали можливими тільки завдяки розвитку техніки (створенням електронного мікроскопа, ультрацентрифуг, використанням радіоізотопних методів дослідження).

В біохімії широко застосовують седиментацію, оптичні та електрохімічні методи, різні види хроматографії, радіоімунні дослідження тощо.

Центрифугування. В основу цього методу покладено розділення неоднорідних систем (суспензій, емульсій) у полі дії доцентрових сил. Під дією цих сил суспензій розділяються на тверду фазу – осад і на рідку фазу – центрифугат, який називають також супернатантом або надосадовою рідиною. Розрізняють препаративне і аналітичне центрифугування. Препаративне центрифугування використовують для очищення та фракціонування біологічного матеріалу. Отримані фракції піддаються подальшому аналізу з метою вивчення структури та біологічної активності макромолекул. Для цього методу використовують звичайні центрифуги (g < 3500), а ультрацентрифуги (g > 3500) використовують з аналітичною метою для визначення молекулярної маси біологічно активних речовин та виділення їх окремих фракцій із розчинів. Крім того розрізняють зональне (досліджувана проба (білки або клітини) розміщуються тонким шаром над буферним розчином) та ізопікнічне (коли часточки проби рівномірно розподіляються по всьому об’єму розчину) центрифугування.

Оптичні методи дослідження. До оптичних методів дослідження належать фотоелектроколориметричні, спектрофотометричні, флуоресцентні та ін.

Спектральний аналіз – фізико-хімічний метод якісного і кількісного визначення атомного та молекулярного складу речовин, ґрунтується на дослідженні спектрів, що поглинаються або випромінюються речовинами, які аналізуються. За допомогою атомного спектрального аналізу визначають елементний склад зразка за атомними (іонними) спектрами поглинання (абсорбції) і випромінювання (емісії). Молекулярний спектральний аналіз застосовують для визначення молекулярного складу речовин за молекулярними спектрами поглинання, розсіювання, флуоресценції або люмінесценції.

Абсорбційна фотометрія – метод фізико-хімічного аналізу, що ґрунтується на вимірюванні ступеня ослаблення монохроматичного світлового потоку внаслідок вибіркового поглинання світла розчиненою речовиною. До цих методів належать:

- спектрофотометрія (колориметрія) – вимірювання інтенсивності забарвлення розчину досліджуваної речовини відносно інтенсивності забарвлення еталонного розчину з достовірно відомою концентрацією. Вимірювання поглинання прозорих розчинів проводять в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній ділянках спектра (220-1100 нм);

- нефелометрія – метод аналізу, пов’язаний із оцінюванням ступеня каламутності досліджуваного розчину. За допомогою цього методу можна визначити кількість білка в біологічному середовищі за ступенем помутніння, яке спричинюють реактиви.

Фотоколориметрія – метод вимірювання поглинання видимої частини спектра забарвленими розчинами. У клінічній практиці цей метод використовують для кількісного визначення піровиноградної кислоти, холестерину, сіалових кислот, сечовини та інших біомолекул та активність багатьох ферментів сироватки крові, сечі.

Спектрофлуориметрія – основана на ефекті флуоресценції, який виникає в результаті енергетичного збудження досліджуваної речовини під впливом короткохвильового випромінювання. Цей метод дозволяє здійснювати якісний та кількісний аналіз макромолекул, а також досліджувати механізми ферментативних реакцій.

Імунофлуорисценція – метод аналізу біологічних зразків на вміст та ідентифікацію специфічних антитіл.

Полуменева фотометрія. Як енергетичний агент, що зумовлює стан збудження досліджуваної речовини, використовують полум’я газового пальника. Іони металів забарвлюють полум’я відповідно до характерних для них спектрів випромінювання. Найчастіше використовують для визначення концентрацій натрію та калію (іноді кальцію та літію) у біологічному матеріалі.

Електрофорез – метод розділення заряджених частинок в електричному полі.

Хроматографічні методи дослідження. Ці методи застосовуються для кількісного визначення білків і амінокислот, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ліпідів та інших метаболітів.

Види хроматографічного методу аналізу:

• адсорбційна хроматографія – ґрунтується на різній здатності окремих сполук адсорбуватися на тих чи інших сорбентах;

• іонообмінна – ґрунтується на різній здатності речовин, які розділяють, до іонного обміну з тим чи іншим іонітом;

• рідинна – широко використовується у фармакології – при синтезі та визначенні лікарських засобів, у клінічній біохімії – для визначення біологічно активних речовин у біологічних рідинах;

• розподільна – ґрунтується на різній розчинності речовин, які розділяють, у двох рідинах, що частково змішуються;

• дифузна – заснована на розділені речовин за швидкістю дифузії всередину сорбенту;

• афінна (хроматографія за спорідненістю) – ґрунтується на використанні нерозчинних форм біологічно активних речовин, що мають спорідненість до речовин, які розділяють.

Хроматографічні методи дослідження застосовують у фармацевтичній промисловості для розділення та очищення антибіотиків, пептидів, гормонів, амінокислот, нуклеїнових кислот, для очищення речовин від домішок, концентрування та розділення сумішей. З науковою метою хроматографію застосовують для дослідження механізмів ферментативних реакцій, виявлення проміжних стадій метаболізму, розділення жирних кислот, спиртів, естерів, амінів. За допомогою цього методу можна розділити будь-які радіоактивні нукліди.

Електрохімічні методи аналізу. Електрохімічні методи ґрунтуються на вивченні явищ, що відбуваються на електродах або в міжелектродному просторі. В електрохімічних методах дослідження використовують вимірювання залежності сили струму в розчині від прикладеного до електрода потенціалу (полярографія); вимірювання величин рівноважних електродних потенціалів або залежність потенціалу електрода від складу розчину (потенціометрія); вимірювання електропровідності розчинів у результаті хімічних реакцій, змін концентрації, температури тощо (кондуктометрія); вимірювання кількості електричного струму, витраченого при кількісному електрохімічному перетворенні речовин (кулонометрія).

Полярографія — електрохімічний метод, в основі якого лежить автоматична реєстрація сили струму при поступовому збільшенні напруги на електродах, занурених у досліджуваний розчин. Під час проходження струму в процесі електровідновлення або електроокиснення на полярограмах з’являються ділянки, на яких сила струму пропорційна концентрації реагуючих речовин. Зміна висоти полярограм дає уявлення про концентрацію речовини.

Потенціометрія ґрунтується на залежності потенціалу електрода від фізичних та фізико-хімічних процесів, що відбуваються в розчині. Величина потенціалу залежить від складу та концентрації (активності) йонів у розчині, характеру хімічних реакцій, природи електрода та інших чинників. При постійній величині потенціалу одного електрода за значенням електрорушійної сили можна визначити потенціал другого електрода редокс-пари.

Кондуктометрія. Однією з найважливіших фізико-хімічних властивостей водних розчинів є здатність проводити електричний струм, що зумовлено переміщенням катіонів та аніонів у електроліті. Здатність розчину проводити електричний струм характеризує його опір і електропровідність.

Радіонуклідні методи дослідження. Ці методи ґрунтуються на використанні радіоактивних ізотопів (радіоізотопів, радіонуклідів). Основна перевага їх перед іншими фізико-хімічними методами — висока чутливість. Сучасна техніка методу радіоактивних міток дає змогу визначити вміст багатьох речовин у кількості до 10-12 моль/л. Інша важлива перевага цього методу — радіонуклід можна вводити в живий організм і проводити дослідження інтактного організму.

Використання радіонуклідних методів дає можливість проводити дослідження на рівні як клітини, так і організму. За допомогою радіонуклідів установлюють шляхи метаболізму різних сполук. Речовину, мічену радіонуклідом, уводять у організм, а потім у певні моменти часу беруть проби, екстрагують з них продукти реакції і аналізують їх. Радіонукліди широко використовують у клінічній медицині (особливо для діагностики), фармакології, екології тощо.

Імуноферментний аналіз (ІФА). Цей метод поєднує в собі високу специфічність імунологічних реакцій з чутливою каталітичною дією ферментів. ІФА використовують для вивчення будови та функції білків, їх біосинтезу й катаболізму, для визначення широкого спектра речовин — гормонів, онкомаркерів, серцевих алкалоїдів, антибіотиків, наркотиків та інших фармакологічних речовин, а також вірусів, бактерій і антитіл проти них тощо.

Основою цього методу є реакція “антиген—антитіло”, тобто специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною.

Для кількісного аналізу застосовують переважно два типи виконання ІФА. Першим етапом їх здійснення є зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. У подальшому стає можливим проведення реакції конкурентного, або непрямого (“сендвіч”), типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. За другим варіантом біологічні рідини реагують з іммобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решту суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже іммобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, що містять речовину, яку визначають, вміщують у лунки планшета для мікротитрування, на стінках яких сорбовані антитіла, здатні специфічно зв’язувати певну речовину, наприклад гормон. Одночасно в інкубаційну суміш вносять невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат, який конкурує з гормоном за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після того як зв’язування антигенів відбулося, незв’язані молекули відмивають.

Для визначення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вно¬сять субстратний буфер і забарвлені продукти ферментативної реакції визначають фотометрично. Чим більша кількість гормону міститься в тестованій пробі, тим менше кон’югату зв’язуватиметься з антитілами. Кількісне оцінювання здійснюють за допомогою калібрувальної кривої, яку будують за стандартними зразками з відомою концентрацією.

Ферменти-маркери в методі ІФА виконують роль індикаторів імунологічних реакцій. Концентрація речовин, що реагують, пропорційна інтенсивності забарвлення, флуоресценції або хемілюмінесценції, за якими визначають ферментативну активність.

Для проведення ІФА використовують пероксидазу, лужну фосфатазу, галактозидазу, глюкозидазу, уреазу, пірофосфатазу та інші ферменти.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). ПЛР застосовують для діагностики захворювань, що передаються статевим шляхом. Реакція дає змогу множити певні нуклеотидні послідовності до кількостей, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу. ПЛР є багаторазово повторюваними циклами синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК-полімерази, дезоксинуклеозидтрифосфатів, відповідного сольового буферу та олігонуклеотидних затравок — праймерів, які визначають межі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені.

Для діагностики кожної інфекції добирають системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дають змогу ампліфікувати фрагмент, що має для кожної системи праймерів свою довжину.