1.6. Ферменты

В живых организмах постоянно происходят самые разнообразные химические реакции. При фотосинтезе, дыхании, усвоении питательных веществ, в процессах синтеза и распада белков, жиров, углеводов, витаминов и др. соединений мы постоянно встречаемся со многими сложнейшими реакциями, лишь с трудом воспроизводимыми вне организма, а значительное количество из них вне организма пока еще воспроизвести невозможно. Между тем в организмах эти реакции протекают очень легко и с большой скоростью. Большое различие в скоростях реакций внутри и вне организмов и сама возможность прохождения многих реакций внутри организмов объясняется тем, что в любой живой клетке находятся многочисленные биологические катализаторы, называемые ферментами или энзимами (фермент - от лат. fermentum – закваска; энзимы - от греч. -enzyme - дрожжи -в дрожжах) которые способны в тысячи и даже в миллионы раз ускорять течение химических реакций.

Начало изучения ферментов относится к 1814 г., когда русский ученый К.С. Кирхгоф показал, что в прорастающем зерне содержится вещество, способное превращать крахмал в сахар.

В настоящее время уже описано более 1500 ферментов. Учение о ферментах выделилось в интенсивно развивающуюся область биохимии - энзимологию или ферментологию, которая тесно связана с физиологией, микробиологией, генетикой, медициной и другими науками.

Изучение ферментов имеет очень большое практическое значение, т.к. многие отрасли промышленности - виноделие, сыроварение, производство чая, табака, аминокислот, органических кислот, витаминов, антибиотиков - основаны на использовании различных ферментативных процессов.

В товароведении пищевых продуктов учение о ферментах занимает одно из центральных мест, так как в основу процессов, происходящих при переработке и хранении пищевых продуктов, лежат ферментативные изменения.

Ферменты - специфические катализаторы белковой природы, ускоряющие течение определенных химических реакций и играющие важнейшую роль в обмене веществ.

Механизм действия ферментов связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции. Для взаимодействия двух веществ, осуществления между ними химической реакции, требуется сближение молекул этих веществ. Чем больше столкновений между молекулами в единицу времени, тем быстрее протекает реакция. Однако лишь немногие столкновения приводят к химическому взаимодействию между молекулами. Объясняется это тем, что при сближении взаимодействуют только молекулы, которые обладают доста­точной для этого энергией. Такие молекулы можно назвать активными или активированными. Избыточное количество энергии, необходимое для прохождения реакции между молекулами при столкновении, называется энергией активации.

При ферментативном катализе реагирующее вещество, так называемый субстрат, соединяется с ферментом, в результате молекулы субстрата становятся более активными. При соединении с ферментом энергетический уровень молекул значительно возрастает вследствие поляризации, смещения электронов, деформации связей. После соединения с ферментом молекулы субстрата поднимаются на более высокий энергетический уровень, поэтому для преодоления ими энергетического барьера требуется значительно меньше энергии, чем до соединения субстрата с ферментом.

Допустим, что происходит реакция распада сложного вещества АВ на два более простых соединения по схеме АВ  А+В, Для расщепления этого вещества необходимо затратить какое-то количество энергии. Если эта реакция идет в присутствии фермента Е, то схема ее будет следующей: АВ + Е  ABE (образование комплекса вещества АВ с ферментом Е), а затем происходит распад комплекса: ABE BЕ+A и ВЕ  В+Е. Фермент принимает участие в реакции, но выходит из нее в неизменном состоянии. Сущность действия фермента заключается в том, что он, направляя реакцию обходными путями, снижает энергию активации, необходимую для протекания данной реакции. Иными словами, при образовании соединения фермент - субстрат величины энергии активизации уменьшаются.

По сравнению с неорганическими катализаторами ферменты обладают более сильным действием. Так, для разложения перекиси водорода на воду и кислород без катализатора требуется энергия активации 18000 кал. на 1 моль, при использовании в качестве катализатора коллоидной платины энергия активации понижается до 11700 кал. на I моль, а при действии фермента каталазы - до 1700 кал.

Кроме более сильного действия, между ферментами и неорганическими катализаторами имеются другие существенные различия. Они заключаются в особенностях химического строения и свойств ферментов, в большей лабильности ферментов и зависимости их каталитического действия от ряда факторов: температуры, кислотности, окислительно-восстановительного потенциала среды, присутствия в среде так называемых активаторов и ингибиторов. Наконец, характерное свойство ферментов - ярко выраженная специфичность их действия. Рассмотрим кратко эти свойства ферментов.

Все ферменты образует коллоидные растворы и имеют высокий молекулярный вес. Свойство ферментов образовывать коллоидные растворы очень важно для жизнедеятельности организмов, так как благодаря этому предотвращается диффузия ферментов из клеток растений, и ферменты, а следовательно и катализируемые ими биохимические реакции, остаются строго локализованными в отдельных клетках, частях клеток растений и внутриклеточных структурах.

Большинство ферментов растворимо в воде, но это не значит, что все они в растительной клетке находятся в растворенном состоянии, значительная часть их прочно связана с клеточными структурами: ядрами, пластидами, митохондриями, микросомами.

При разрушении клеточных структур и переходе ферментов из адсорбированного в растворенное состояние согласованность и взаимосвязь ферментативных процессов резко нарушается и клетка гибнет.

Молекулярный вес ферментов обычно колеблется в пределах 10⁴-10⁵, но иногда превышает эту величину. Например, молекулярный вес пероксидазы около 40000, пепсина 35000, -амилазы около 60000,  - амилазы около 150000, каталазы 250000, уреазы 480000.

Установлено, что каждый фермент содержит белок и что каталитические функции ферментов теснейшим образом связаны с белковыми веществами.

Все ферменты разделяют на два больших класса: однокомпонентные и двухкомпонентные. К первому классу относят ферменты, состоящие только из белка, обладающего каталитическими свойствами, а ко второму классу - ферменты, которые состоят из белка и связанной с белком небелковой части, так называемой простетической, или активной, группы. Активные группы могут быть отделены от белковой части молекулы фермента. Для названия активных групп двухкомпонентных ферментов часто используют термин кофермент. Белковую же часть в двухкомпонентных ферментах называют апоферментом. В разных ферментах один и тот же кофермент может быть связан с ними очень слабо или весьма прочно.

К двухкомпонентным ферментам относятся окислительно-восстановительные ферменты - пероксидаза, полифенолоксидаза, цитохромоксидаза, большинство дегидрогеназ.

В качестве коферментов в двухкомпонентных ферментах выступают соединения различных классов: нуклеотиды, витамины, порфирины, группировки содержащие атомы металлов. Коферментами многих дегидрогеназ являются никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ). Однако большинство ферментов состоит лишь из одного компонента - белка. В настоящее время около 200 таких однокомпонентных ферментов получено в чистом кристаллическом виде. Они образуют кристаллы различной формы.

У однокомпонентных ферментов роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в белок. Эти группировки получили название активных центров ферментов.

Активный центр - часть молекулы ферментного белка, с помощью которой фермент соединяется с субстратом и от которой зависят каталитические свойства фермента. Активные центры в молекулах ферментов представляют собой определенные, специфические для каждого фермента группировки аминокислот, расположенные в строго определенной последовательности.

В состав активных центров однокомпонентных ферментов входят белковые группы не всех, а лишь некоторых аминокислотных остатков, из которых наибольшее значение имеют SH-группы цистеина, ОН-группы серина, имидазольное кольцо гистидина, а также карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот и индольная группа триптофана. Строение активных центров ферментов и механизм взаимодействия их с субстратами изучены еще недостаточно.

Как известно, скорость всех химических реакций при повышении температуры возрастает; увеличивается и скорость химических реакций, катализируемых ферментами. Температура, при которой наблюдается наиболее интенсивное действие фермента, называется оптимальной.

Температурный оптимум большинства растительных ферментов 40-60°С, а большинства животных ферментов 40-50°С. При более высоких температурах активность ферментов резко понижается и почти все они необратимо разрушаются при 70-80°С. Тепловая инактивация ферментов происходит вследствие денатурации белка при высокой температуре. Это свойство ферментов также отличает их от неорганических катализаторов.

Второй важнейший фактор, от которого зависит активность ферментов, - реакция среды. Каждый фермент наиболее активен в определенном интервале рН. Оптимумы рН отдельных ферментов резко различаются. Например, максимальная активность пепсина, катализирующего расщепление белка, наблюдается при рН 1,5-2,0, а аргиназы, которая вызывает расщепление аминокислоты аргинина, - при рН 9,5-9,9.

Наивысшая активность большинства растительных ферментов отмечается при слабокислой или нейтральной реакции, которая характерна для растительных клеток.

Активность ферментов в сильной степени зависит от содержания в реакционной среде различных дополнительных ионов или соединений.

Вещества, которые усиливают каталитическую активность ферментов, получили название активаторов. Роль активаторов ферментов часто выполняют ионы различных металлов: Са²⁺, Мg²⁺ , Zn²⁺, Fe²⁺ , Сu²⁺, Мn²⁺ и др.

Усиление активности ферментов под действием ионов металлов объясняется прежде всего тем, что многие ферменты содержат тот или иной металл в своей молекуле и представляют собой так называемые металлоферменты. Если путем диализа или какими-либо другими способами удалить металл из молекулы фермента и из реакционной среды, действие фермента полностью прекращается.

Активаторами ферментов могут быть и другие вещества. Так, активность амилазы повышается в присутствии ионов йода, брома и хлоридов; протеолитические ферменты, катализирующие расщепление белков, становятся более активными при наличии в среде HCN, H₂S и др.

Существуют вещества, которые подавляют действие ферментов. Они получили название ингибиторов ферментов. Ферментативные ингибиторы можно разделить на две группы: ингибиторы общие и специфические. К общим ингибиторам относятся соли тяжелых металлов - свинца, серебра, ртути и др., которые денатурируют белки, и, следовательно подавляют действие всех ферментов.

Наибольшее значение имеют специфические ингибиторы, которые действуют на одну ферментативную реакцию или на группу близких реакций. Важными ингибиторами являются фосфоорганические соединения, сульфгидрильные группы.

Ферменты отличаются от неорганических катализаторов высокой специфичностью, т.е. действие каждого фермента строго ограничено одним веществом или группой близких веществ. Специфичность действия ферментов - важнейшее их биологическое свойство, без которого невозможен нормальный обмен веществ в организмах. Если бы ферменты не обладали специфичностью, то это приводило бы к быстрому распаду всех веществ в клетках и к гибели организма.

Различают прежде всего химическую, или абсолютную специфичность, когда каждый фермент действует на определенное химическое вещество.

Например, фермент уреаза катализирует гидролитическое расщепление только мочевины, фермент каталаза катализирует распад только перекиси водорода, но не действует на другие перекиси.

Групповая специфичность ферментов заключается в том, что фермент катализирует расщепление определенных химических связей в отдельных группах близких по строению веществ. Например, липазы катализируют гидролитический распад различных сложных эфиров, пепсин расщепляет всевозможные белки, кислая фосфатаза гидролизует разные моноэфиры ортофосфорной кислоты.

Характерным свойством ферментов, резко отличающим их от неорганических катализаторов, является стереохимическая специфичность действия. Она заключается в том, что ферменты часто действуют только на определенные стереоизомеры органических соединений.

В качестве примера стереохимической специфичности ферментов можно рассмотреть действие  и  -гликозидазы. Они катализируют гидролитическое расщепление гликозидов; -гликозидаза действует только -гликозиды,  -гликозидаза - на  -гликозиды.

Решающее значение на специфичность ферментов оказывает определенная конфигурация активной части молекулы фермента.

В соответствии с классификацией, разработанной Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, все ферменты подразделяются на шесть классов:

I. Оксидоредуктазы - окислительно-восстановительные ферменты.

2. Трансферазы - ферменты, катализирующие реакции переноса групп.

3. Гидролазы - гидролитические ферменты.

4. Лиазы - ферменты, катализирующие отщепление от субстратов от­дельных групп с образованием двойных связей или присоединение групп к двойным связям.

5. Изомеразы - ферменты, катализирующие реакции изомеризации.

6. Лигазы (синтетазы) - ферменты, катализирующие реакции синтеза с участием АТФ или аналогичных трифосфатов.

Название фермента образуется путем прибавления суффикса «аз» к названию субстрата или процесса, который протекает под влиянием фермента. Так, фермент, действующий на сахарозу, называют сахаразой, или инвертазой; мальтозу - мальтазой; крахмал (амилозу) - амилазой; белок (протеин) - протеиназой и т.д.

Оксидоредуктазы – это ферменты, катализирующие многочисленные окислительно-восстановительные реакции. Окисление веществ может идти путем присоединения кислорода или отщепления водорода. Установлено, что подавляющее большинство биологических окислений обусловлено не присоединением кислорода к окисляющейся молекуле, а дегидрированием - отщеплением водорода. Отщепление водорода от окисляемых субстратов катализируется ферментами, которые получили название дегидрогеназ. Схему действия дегидрогеназ можно изобразить следующим образом:

дегидрогеназа

АН₂ + В  А + ВН₂

Восстановленное вещество АН₂, которое служит донором водорода, под действием дегидрогеназ передает его веществу В. Вещество А окисляется, а вещество В восстанавливается.

В зависимости от способности окислительно-восстановительных ферментов передавать отщепляемый от окисляемого субстрата водород непосредственно на кислород воздуха различают аэробные дегидрогеназы (или оксидазы) и анаэробные дегидрогеназы.

Оксидазы - ферменты, способные переносить водород от окисляемогс вещества непосредственно на кислород воздуха, а анаэробные дегидрогеназы - ферменты, неспособные переносить водород на кислород воздуха.

Анаэробные дегидрогеназы передают отщепляемый водород другим акцепторам, другим ферментам, другим переносчикам водорода.

Важнейшими дегидрогеназами являются: лактатоксидаза (катализирует превращение молочной кислоты в уксусную), альдегидаксидаза (участвует в реакции окисления альдегидов с образованием соответствующих кислот и перекиси водорода), аскорбинатоксидаза (катализирует окисление аскорбиновой кислоты – витамина С) и др.

Окислительно-восстановительные процессы, происходящие в живых организмах и во многих пищевых продуктах, объединяются главным образом брожением и дыханием.

Дыхание и брожение, а также тесно связанный с ним и процесс гликолиза имеют исключительно большое значение для товароведения, т.к. большинство пищевых продуктов являются живыми организмами и протекающие в них окислительно-восстановительные процессы непосредственно влияют на их состояние в процессе хранения и перевозки. С другой стороны, после прекращения жизни этих организмов под влиянием ферментов окислительно-восстановительные процессы продолжаются, изменяется лишь их направление, что имеет специфическое влияние на качество продуктов.

С окислительно-восстановительными процессами связаны такие изменения пищевых продуктов, как созревание мяса, созревание и старение алкогольных напитков, ферментация чая и табака, потемнение плодов и овощей при их переработке и ряд других.

Зная механизм окислительно-восстановительных реакций, протекающих в пищевых продуктах, как правило, с участием ферментов, можно их регулировать и направлять так, чтобы содействовать улучшению качества продуктов или предохранить их от нежелательных изменений.

Трансферазы. В реакциях обмена веществ большую роль играют ферменты, катализирующие перенос отдельных радикалов, частей молекул и даже целых молекул от одних соединений на другие. Такой перенос атомных группировок значительно ускоряет и облегчает течение биохимических реакций, особенно синтетических. Все реакции такого типа катализируются ферментами переноса, или трансферазами. Общая схема реакций, катализируемых ферментами переноса, может быть изображена следующим образом:

АХ + В  А + ВХ

Реакция, вероятно, идет в две фазы:

АХ + Е  A + ÅX;

EX + В  Е + ВХ.

На первой фазе фермент (условно Е) отщепляет атомную группировку X и образует с ней комплексное соединение, а вещество А освобождается. На второй фазе фермент катализирует присоединение группировки X к веществу В, а сам освобождается в неизмененном состоянии.

Представители трансфераз: метилтрансферазы, карбоксилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы, сульфидтрансферазы и др.

Для товароведения пищевых продуктов эти ферменты менее важны.

Гидролазы. Ферменты класса гидролаз катализируют гидролиз, а иногда и синтез сложных соединений с участием воды:

RR₁ + HOH  ROH + R₁H

При переработке сырья и хранении готовой продукции преобладающими являются гидролитические процессы расщепления. Гидролазы делят на несколько подклассов. Первый подкласс: гидролазы, действующие на сложноэфирные связи (эстеразы); гидролазы эфиров глицерина (липаза); гидролазы фосфомоноэфиров и др.

Липаза - весьма распространенный в природе фермент, который встречается в различных частях животных организмов (мышцах, печени, соке поджелудочной железы, сыворотке крови), растений (особенно в семенах). Липаза содержится также во многих микроорганизмах.

Особое значение имеет липаза в связи с переработкой и хранением жиросодержащих пищевых продуктов.

Этот фермент расщепляет жиры по следующей схеме:

СН2ОСОR1				СН2ОН		R1СООН
						
СНОСОR2	+	3Н2О		СНОН	+	R2СООН
						
СН2ОСОR3				СН2ОН		R3СООН

триглицерид глицерин жирные

кислоты

(стеариновая,

олеиновая,

пальметиновая)

R₁, R₂, R₃ – остатки жирных кислот.

Второй подкласс гидролитических ферментов катализирует расщепление гликозильных соединений:

ROR₁ + HOH  ROH + R₁OH

Среди этих ферментов наиболее распространены гидролазы гликозидов, катализирующие гидролитическое расщепление углеводов и гликозидов. К этим ферментам относятся α, β-амилазы, ускоряющие расщепление крахмала; целлюлаза, катализирующая расщепление целлюлозы; инулаза, расщепляющая полисахарид инулин; α -глюкозидаза, превращающая дисахарид мальтозу в две молекулы глюкозы и др.

Третий подкласс- пептидазы, или протеолитические ферменты, катализируют гидролитическое расщепление пептидных -СО- -NН-связей в белках или пептидах:

RCO-NHR₁ + HOH  RCOOH + R₁NH₂

где R и R₁ - остатки аминокислот или пептидов.

Известно несколько десятков ферментов этого типа, из которых наиболее хорошо изучены ферменты желудочного сока –пепсин, трипсин, химотрипсин, а также растительный фермент папаин. Все они представляют собой однокомпонентные ферменты; получены в кристаллическом состоянии и достаточно хорошо изучены.

Четвертый подкласс - дезамидазы и дезаминазы - чаще всего катализируют гидролитическое дезамидирование амидов, а также азотистых оснований и нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот. Представители - аспарагиназа, глутаминаза, пирофосфатаза, аденозинтрифосфатаза и некоторые другие ферменты.

Лиазы – катализируют отщепление от субстратов тех или иных групп без какого-либо участия воды или фосфорной кислоты. В результате действия этих ферментов образуются двойные связи. Лиазы могут участвовать в присоединении отдельных групп или радикалов к двойным связям.

Класс лиаз делят на несколько подклассов:

– углерод-углерод-лиазы - многочисленные ферменты, катализирующие отщепление или присоединение углекислоты. Отщепление углекислоты от органических соединений часто происходит в процессах обмена веществ в растениях;

– углерод-кислород-лиазы - многочисленная группа ферментов, которая катализирует отщепление от субстрата водорода и гидроксила, образующих затем воду;

углерод-азот-лиазы - ферменты, катализирующие присоединение и отщепление азотистых соединений. ^IПредставители: альдолаза, цитрат-синтаза, аспартат-аммиаклиаза и др.

Изомеразы, или ферменты изомеризации, катализируют превращение органических соединений в их изомеры. Изомеризация происходит вследствие внутримолекулярного перемещения атомов, атомных группировок, остатков фосфорной кислоты, различных радикалов. Веществами, которые часто подвергаются изомеризации, могут быть углеводы и их производные, органические кислоты, аминокислоты, и поэтому ферменты этой группы играют большую роль во многих процессах обмена веществ.

Представители - триозофосфат-изомераза, рибулозо-5-фосфат-3 эпимераза и др.

Лигазы или синтетазы - большая группа ферментов, которые ускоряют синтез сложных органических соединений из более простых. В связи с тем, что реакции синтеза требуют затрат значительного количества энергии, активность лигаз проявляется лишь в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты или других макроэнергических соединений.

Все лигазы разделяют на подклассы в зависимости от того, какие связи образуются при их участии. Различают С-О лигазы, С-N лигазы и С-С лигазы.

Распространенные реакции, катализируемые лигазами, - это реакции синтеза амидов (аспарагина и глутамина); ферменты аспарагинсинтетаза, глутаминсинтетаза.

Изоферменты. Длительное время считалось, что каждый фермент представляет собой индивидуальное химическое вещество белковой природы, катализирующее определенную химическую реакцию или несколько близких реакций. Однако биохимик О. Варбург, изучая активность фермента альдолазы в различных условиях, наблюдал, что альдолазы, выделенные из дрожжей и из различных животных тканей, различаются по ряду своих свойств. Несколько позднее другие исследователи показали, что пепсин, трипсин, химотрипсин и некоторые другие ферменты также могут отличаться по ряду свойств и встречаться в различных формах.

Название изоферменты означает множественность форм ферментов, встречающихся у одного и того же биологического вида.

При характеристике индивидуальных ферментов, как правило, указывается вид, орган или ткань, служащие их источником.

Одни и те же ферменты, выделенные из одних и тех же тканей, у различных биологических видов, имеют неодинаковые свойства.

В настоящее время наиболее хорошо изучены изоферменты лактатдегидрогеназы (АД). Из различных органов были выделены пять изоферментов лактатдегидрогеназы: ЛД₁, ЛД₂, ЛД₃, ЛД₄, ЛД₅; причем они отличаются друг от друга рядом признаков, в том числе и электрофоретической подвижностью в направлении к аноду.

В товароведении пищевых продуктов учение о ферментах занимает одно из центральных мест, так как в основу процессов, происходящих при переработке и хранении пищевых продуктов, лежат ферментативные изменения. Более того, и микробиологические процессы, происходящие при переработке и хранении пищевых продуктов, могут быть объяснены только действием тех или иных ферментов. Например, в настоящее время мы не можем объяснить без знания ферментов такие важные процессы, как созревание сыров, различные виды брожения, ферментация табака, чая, кофе, хранение зерновой массы, плодов и овощей, картофеля. Эти ферментативные реакции обусловлены частично ферментами, содержащимися в самих товарах, частично ферментами микроорганизмов, принимающих участие в соответствующих процессах. Можно сказать, что с действиями ферментов связаны такие явления, как морозоустойчивость, урожайность, скороспелость, стойкость растительных продуктов при хранении. Вряд ли имеется такой раздел в товароведении пищевых продуктов, который можно было бы изучить без знания ферментов и ферментативных процессов.

Ферментативные препараты широко применяются в народном хозяйстве (пищевой промышленности, медицине, кожевенной промышленности и др.). Протеолитические ферменты применяют в производстве мучных кондитерских изделий, хлеба, для смягчения мяса, для обработки сырной пасты, сухого молока, диетических продуктов, обогащения круп белками, при переработке рыбы и др. Их используют для стабилизации пива, фруктово-ягодных соков, как заменители солода (амилаза).

Превращения, происходящие в пищевых продуктах не только при переработке, но и их хранении, совершаются при содействии разнообразных ферментов. Все эти сложнейшие превращения протекают при биологических или даже более низких температурах, в то время как для аналогичных превращений в искусственных условиях (с помощью физико-химических реакций, например осахаривание крахмала, расщеп­ление целлюлозы, сахарозы и др. веществ) необходимо затратить значительно больше средств и времени. Отсюда ясно, что экономический эффект использования ферментов в пищевой промышленности исключительно высок. Собственно, этим и можно объяснить, что за последние годы производству и применению ферментных препаратов во всех странах мира уделяется такое большое внимание.