Молекулярно-біологічний метод
Метод заснований на дослідженні родо- або видоспецифічних послідовностей дезоксирибонуклеінової (ДНК) або рибонуклеінової кислоти (РНК) мікроорганізму, що дозволяє судити про наявність збудника у зразку від хворого (специфічність понад 99%) [303].
Для дослідження використовувалась тест-система для визначення VZV (НПФ «ДНК-Технология», Россия) за допомогою ампліфікатору «My Cycler» («Bio-Rad», США).
Зразки крові відбирались в стерильну пробірку типу «Vacutainer» з EDTA (4,5мл), зразки слини – в суху чисту пробірку типу «Eрpendorf» (KJ072), а зразки вмісту везикул – в пробірку типу «Eрpendorf» (KJ072) з транспортним середовищем. Після відстоювання зразків крові в пробіркках «Vacutainer» з EDTA – мікропіпеткою в суху чисту пробірку типу «Eрpendorf» (KJ072) відбиралась надосадова рідина (плазма), яка заморожувалась до -70°С.
У всіх стаціонарних хворих досліджували кров, слину та вміст везикул на присутність генетичного матеріалу VZV до лікування (період розпалу хвороби) та у періоді реконвалесценції (перед випискою зі стаціонару). При повторному обстеженні хворих на ВВ, які перебували в періоді реконвалесценції (клінічне одужання), в якості біоматеріалу досліджувалась лише кров та слина.
Облік результатів ПЛР – аналізу проводився за визначенням на електрофореграмі специфічних полос ампліфікованої ДНК (269 пар нуклеотидів для VZV, 590 пар нуклеотидів для внутрішнього контролю) за допомогою електрофоретичної камери з фотометричною документуючою системою «Gel Doc» («Bio-Rad») з наступною обробкою результатів за допомогою комп’ютерного програмного забезпечення «Quantity One» 4.6.1. (рис. 2.4).
Рис. 2.4. Фотометричний відбиток результату ПЛР дослідження:
«К+» – позитивний контроль ампліфікації, вказує відповідну довжину пар нуклеотидів;
«ОКО» – негативний контроль виділення;
«К–» – негативний контроль ампліфікації;
«1 – 22» – біологічний матеріал з везикул від окремих пацієнтів;
«23с» – біологічний матеріал з везикули пацієнта;
«23b» – біологічний матеріал зі слини пацієнта;
«23a» – біологічний матеріал з крові пацієнта.
Інтерпретація зображення з монітору (рис. 2.4) чітко визначає, що зразки номер 1–22 та 23с містять ДНК VZV у везикулах, а результат дослідження розцінено як позитивний. Відповідно, зразок номер 23b містить ДНК VZV у слині, а 23а – у крові, що також розцінюється як позитивний результат.
2.4. Методи статистичного аналізу
Статистична обробка отриманих даних проводилась на персональному комп’ютері, після створення автором бази даних за допомогою програми Microsoft Office Excel 2003 (стовпчики відповідали досліджуваним перемінним, рядки окремим спостереженням – хворі з ВВ). Для більш коректного статистичного аналізу отриманих даних застосовували пакет прикладних статистичних програм Statistica 8.0 [304, 305].
Первинна статистична обробка створеної бази даних встановила наявність наступних категорій перемінних: кількісні, біноміальні, категорії та мітки. З урахуванням цього, а також поставлених завданнь дослідження, були застосовані наступні методи статистичної обробки інформації:
визначення нормального розподілу величин;
описова статистика;
параметричне та непараметричне порівняння незалежних груп (коефіцієнт Стьюдента або Фішера, критерій Мана-Уїтні);
побудова таблиць частот та зв’язаності (кростабуляції) з визначенням відношення шансів та достовірності (тест Макнемара для залежних груп);
параметричний та непараметричний кореляційний аналіз;
багатофакторний (дискримінантний) аналіз.
При проведені перевірки отриманих даних на нормальність розподілу величин, були побудовані гістограми розподілу ознак. Аналіз гістограм встановив, що розподіл досліджуваних кількісних ознак наближається до нормального. З цього випливає, що до отриманих даних можуть бути застосовані параметричні методи статистики (t-критерій Стьюдента / Фішера).
Для одержаних результатів встановили критичний рівень статистичної значущості р<0,05, який розцінювали як достовірний.
Таблиці зв’язаності давали змогу оцінити значення абсолютних частот двох чи більше ознак, розташованих у стовпчиках та рядках відповідно. Кростабуляція дозволяє сумістити частоти появи спостережень на різних рівнях факторів та проаналізувати зв’язки між табульованими факторами.
Відношення шансів (ВШ) підраховували на підставі аналізу чотирьохпольної таблиці за формулою 2.1.
ВШ = А х D : B х C |
(2.1) |
де А – верхнє ліве, В – верхнє праве, С – нижнє ліве та D – нижнє праве поля чотирьохпольної таблиці якісних ознак, що відображують абсолютні частоти.
Довірчі інтервали (CI) ВШ визначались за методом Woolf [304].
При проведенні кореляційного аналізу вимірювали значення коефіцієнта кореляції в інтервалі від -1 до +1, при чому функціональну лінійну залежність зі знаком «-» вважали негативною (оберненою), а залежність зі знаком «+» – позитивною (прямою), тощо. При цьому, при інтерпретації кореляційного статистичнго зв’язку, спирались у першу чергу на вірогідність коефіціенту кореляції (р<0,05), а в другу – на числове значення коефіцієнта кореляції, який умовно поділяє зв’язок на слабкий (|r|<0,25) – в дослідженні не враховувався, помірний (|r|=0,25–0,75) та сильний (|r|>0,75) [304, 306].
За допомогою багатофакторного (дискримінантного) аналізу вирішували дві задачі: 1.) прогнозування віднесення об’єкту до тієї чи іншої групи за діагностичною ознакою, 2.) визначення найбільш інформативних ознак з певного, чисельного набору ознак. Проведення дискримінантного аналізу вимагало створення вирішального правила у вигляді регресійного рівняння, за яким класифікували ознаки. Достовірно значущим вважали вірогідність точності моделі р<0,05, при цьому, гранична чутливість моделі має наближатись до 90%.