Замедление роста

Замедления роста можно добиться следующими методами:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических - маннит в концентрации 3-6%.

6. Замена СaCl₂ на Ca(NO₃)₂ в питательных средах.

Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.

Физиологические основы криосохранения

Проблема хранения генофонда растений и их клеточных штаммов стала, в сущности, проблемой криосохранения семян, апексов побегов, эмбрионов и клеток in vitro. Апексы in vitro регенерируют исходный генотип и обеспечивают сохранение не только сортов, форм и видов, вегетативно размножающихся и других растений, но и клонирование отдельных элитных экземпляров.

Таким образом, криосохранение – единственный способ длительного хранения клеточных штаммов, тканей и микроорганизмов.

Термин «криосохранение» (cryopreservation) употребляется для обозначения сложного многоэтапного процесса, который проводится с целью неограниченно долгого сохранениия стабильными живые клетки, ткани и органы в состоянии анабиоза.

Холодовой анабиоз индуцируется в клетках гипотермией и замораживанием до низких температур. Только в состоянии глубокого анабиоза, когда полностью останавливаются обменные, биохимические реакции и отсутствует жидкая фаза, создаются условия для длительного хранения биологической системы с последующим полным возвратом ее к исходному состоянию в условиях нормотермии. Самое главное - это сохранить жизнеспособность клеток, их свойства, а также способность к морфогенезу и регенерации целых растений после воздействия сверхнизких температур.

Единственно надежным средством для решения этой задачи является глубокий холод (-140^оС и ниже), обеспечиваемый наиболее практично с помощью жидкого азота (-196 ^о С).

Таким образом, исследования в области криобиологии направлены на решение фундаментальной проблемы биологии, а именно – перевод биологической системы в состояние искусственного глубокого холодового анабиоза с целью продолжительного хранения с последующим возобновлением роста после оттаивания.

Важнейший этап процесса криосохранения – замораживание. На этом этапе возникают трудности, так как существуют 2 группы объектов, подвергаемых криосохранению.

Первая группа – это ткани, содержание воды в которых минимально (пыльца, семена). Для таких объектов этот процесс достаточно прост. Их можно прямо погружать в жидкий азот и оттаивать впоследствии на воздухе в обычных условиях.

Вторая группа – это большинство растительных тканей. Для них характерны большие размеры клеток, прочная целлюлозная стенка и наличие центральной вакуоли. Причем именно степень вакуолизации клетки (оводненность) играет основную роль в устойчивости к действию низких температур. У таких объектов прием простого замораживания малоэффективен, так как не происходит сохранение всех исходных свойств и жизнеспособности.

Один из повреждающих факторов при замораживании – лед, возникающий сначала в растворе вокруг клеток, а другой – дегидратация клеток, вызываемая ростом кристаллов этого внеклеточного льда.

Первая задача криосохранения – предотвратить образование кристаллов льда внутри клеток. В случае клеток растений эта задача решается труднее, чем для других объектов, вследствие обилия в них свободной воды. Эту трудность можно преодолеть снижением скорости охлаждения или предварительным обезвоживанием клеток. Известно, чем больше воды в клетке, тем меньше должна быть скорость замораживания.

Вторая задача криосохранения – ослабить группу стрессовых воздействий, вызванных неизбежной дегидратацией (денатурация белков, нарушение функционирования мембран, увеличение концентрации ионов до токсических величин, нарушение синтеза нормальных клеточных белков). Чтобы ослабить их действие, необходимы и оптимальный состав смеси протекторов, и оптимальная скорость замораживания, и более того – оптимизация всей программы процесса криосохранения.

В связи с этим возникла необходимость проведения планомерных фундаментальных и прикладных исследований по выяснению механизмов криоповреждений и криозащиты биологических систем разных уровней организации.

Предотвращение внутриклеточного образования льда.

Клетка погибает при образовании льда в протопласте. Безопасны для структур клетки кристаллы размером не более 0,1 мкм.

При медленном замораживании (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) лед образуется в первую очередь в межклетниках. Лед формирует градиент водного потенциала, направленный из клеток в межклетники. Это постепенно приводит к дегидратации клеток и, как следствие, организм успевает приспособиться к низким температурам.

Таким образом, постепенная дегидратация протопласта является одним из необходимых условий выживания клеток при замораживании.