55. Семейство Аденовирусов.

57.Условия транспортировки и хранения вируссодержащего материала в лаборатории. Взятые пробы необходимо как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечивают низкие темпе­ратуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждаю­щей смесью.

Структура упаковочного контейнера:

Первичная емкость: емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся проб­кой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, или запаянная стеклянная ампула);

Внутренняя упаковка: - поглощающий материал — папиросная бумага или вата в количестве, достаточном для впитывания жидкости в случае утечки;

- пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволок­нистым лейкопластырем;

Наружная упаковка: -противоударная прокладка, (скомканная бумага или вата);- твердый водо­непроницаемый контейнер;- плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем или закрепляемая зажимами.

В качестве охлаж­дающей смеси используют смесь равных частей сухого льда (твер­дая углекислота) и этилового спирта, тогда температура минус 71 °С держится несколько дней. Можно использовать смесь, состоящую из трех весовых частей льда или снега и одной весовой части по­варенной соли. В последнем случае удается получить температуру минус 15... 20 °С. Вместо замораживания можно использовать хими­ческие консерванты, но это менее эффективно. Лучшим из них считается смесь равных объемов стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). Обычно эту смесь рекомендуют использовать для консервирования кусоч­ков паренхиматозных органов и тканей.

Глицерин — это простейший трехатомный спирт. Он сме­шивается с большинством компонентов живой клетки. В него бы­стро диффундирует вода и электролиты, а сам он легко проникает в другие растворы и гели и не переходит в твердое состояние при низких температурах - минус 110 °С.

Патматериал снабжают надежной и четкой этикеткой, недопустимо делать надписи карандашом по стек­лу. На пробирке или флакон­чике достаточно надежной является этикетка из лейко­пластыря, которую подписы­вают простым карандашом. На термос с пробами патма­териала навешивают бирку из картона или фанеры, на ко­торою указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос опечатывают. Взятый материал с сопроводитель­ным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, об эпизоотологических данных хозяйст­ва, предположительном диагнозе мерах, принятых для ликви­дации болезни (лечение, вакцинации и т.д.), а также дату и фа­милию ветеринарного врача. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, матери­ал хранят при температуре минус (40... 70) °С.

58. Особенности работы вирусологической лаборатории и её оборудование. Вирусологическая лаборатория используется для проведения лабораторных диагностических исследований на вирусные инфек­ции, контроля состояния и напряженности специфического постинфекционного и поствакцинального про­тивовирусного иммунитета, и участия в профилактических мероприятий с вирусными заболева­ниями.

Как правило, вирусологические лаборатории, независимо от специализации, должны размещаться в чистых светлых помеще­ниях с необходимым оборудованием и мебелью.). Независимо от характера выполняемой работы в них необходимо поддерживать рабочую чистоту. Кроме еже­дневной обычной уборки, помещения периодически обрабатывают растворами дезинфицирующих веществ (карболовой кислоты, ли­зола, хлорной извести, хлорамина и т.п.) и подвергают ультра­фиолетовому облучению. Комнаты, предназначенные для работы с вирусами, должны быть хорошо освещены и состоять из двух от­делений, разобщенных стеклянной перегородкой: предбоксника и бокса. В предбокснике должны быть стерильные халаты, тапоч­ки, маски, которые надевают перед работой, а так же можно размещать дополнительное оборудование.: термостаты, холодильники, центрифуги лабораторные, микроскопы, водяную баню и пр.

В боксе, кроме рабочих столов и стульев, должно быть все необходимое для работы: стерилизаторы для инструментов, банки с дезрастворами для отработанных пипеток, бак с дезраствором для сбора отработанных материалов, баночки со спиртом, йодом, штативы для пробирок, пробирки с бульоном для проверки бактериального загрязнения, стерильные пипетки, ступки и т.д.

Регистрация поступающего на исследование патологи­ческого материала проводят в приемной. В комнате для предварительной обработки материала прово­дят вскрытие трупов и отбор материала для дальнейшего иссле­дованияКомнату для вирусологических исследований оборудуют: термостатами, холодильниками, центрифугами, весами различных типов, электроплитками, фильтрами, насосами, водяными банями, электромагнитными мешалками и т д.. На столах для определенных операций за каждым работаю­щим закрепляют рабочее место. Здесь размещают нужную аппа­ратуру, соответствующие дезинфицирующие средства, краски, реактивы. На операционном столе необходимы микроскоп, набор инструментов (пинцеты, ножницы, скальпели и др.), вата, пасте­ровские пипетки, стерильные и обезжиренные покровные и пред­метные стекла, физраствор. При работе с куриными эмбрионами должны быть подставки для яиц, овоскопы, инструменты для вскрытия (ножницы, глазные пинцеты).

В автоклавной необхо­димо иметь два автоклава, для чистых материалов – где стерилизуют посуду, питательные среды, инструменты, обезвреживают заразный материал - и для инфици­рованных, бак для сбора инфицированного материала. Допускается наличие сушильных шкафов, дистилляторов, столов и шкафов для стерильной посуды.

Моечная предназначена для мытья посуды и приборов. Виварием называется помещение, используемое для выращивания и содержания лабораторных животных. Лабораторных животных содержат в клеткахСотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблю­дать правила, предупреждающие попадание бактерий и плесневых грибов в исследуемый материал и возможность внутрилабораторных заражений персонале и распространения инфек­ции. В лабораторий установлен единый порядок обращения с вирусами, предусматривающий правила их хранения, регистрации, передачи от одного сотрудника другому внутри лаборатории и за ее пределы.

59. Вирус Бешенства. Возбудитель болезни — РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Rhabdoviridae. Как и другие рабдовирусы, он имеет пулевидную форму. Длина вирионов — 180 нм, диаметр — 75 — 80 нм. Вирус удается культивировать в развивающихся куриных и утиных эмбрионах, в культурах некоторых клеток. Штаммы возбудителя бешенства, циркулирующие в природе (уличный вирус), патогенны для всех теплокровных животных. В наиболее высоких титрах вирус накапливается в центральной нервной системе зараженных животных, особенно в аммониевых рогах и коре больших полушарий головного мозга, в мозжечке и продолговатом мозге. Высокий титр возбудителя бешенства и в слюнных и слезных железах. Различают «дикий» (уличный) и «фиксированный» вирусы бешенства. Уличный вирус бешенства циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для людей и животных, образует в мозговых клетках специфические тельца Бабеша - Негри. «Фиксированный» вирус был получен Л. Пастером путем многоразового интрацеребрального пассажа вируса уличного бешенства через организм кролей, вследствие чего вирус потерял свою вирулентность для человека и животных, а также способность образовывать в мозге тельца Бабеша - Негри. Фиксированный вирус используется как исходный материал для изготовления антирабических вакцин. В лаб.напр.труп целиком или голову с 2 первыми шейными позвонками,берут кусочки 1*1см из мозжечка,полушарий,продолг.мозга,амонова рога.

Диагностика: экспресс методы; РИФ, РДП. Биопроба, РН.

60.РДП.

Реакция диффузной преципитации.

Цель: индикация, идентификация и титрование антигена или антитела.

Сущность: Антиген и антитело диффундируют на встречу друг к другу в агаровом геле, и при специфичности, в месте соединения образуется комплекс антиген-антитело в виде светлой полосы – линии преципитации.

Техника постановки:

-микрометод

В агаровом геле по трафарету вырезают 5 луночек, в центральную лунку вносим вирусный материал или стандартную сыворотку с антителами. Вокруг исследуемого объекта, вирус суспензию(заведомо положительный антиген или вирус), заведомо отрицательный антиген, и физиологический раствор. Помещают стекло в трмостат при 37⁰ в условиях влажной ткани. Учёт через 6-12-24 часа, контролем являются заведомо полож. и заведомо отриц. антигены. Линия преципитации обязательно должна быть м/у сывороткой и положит. антигеном.

Не должна быть между антигеном и физ. раствотом.

-макрометод

Тоже самое, что и микрометод, только в чашке петри.

-капилярный метод

Стеклянный каиляр заполняют агаровым гелем, с одной стороны вливают антиген, с другой антитело. Это реакция требует высокой концентрации компонентов.

61. Семейство Тоговирусов (вирусная диарея крс). (Togaviridae), семейство вирусов, состоящее из родов Alphavirus, Flavivirus, Rubivirus и Pestivirus. Вирусы содержат однонитчатую РНК линейной формы, к-рая является инфекционной. Вирионы диаметром 50—70 нм (альфавирусы), 40—50 нм (флявивирусы), 70 нм (рубивирусы), 40 нм (пестивирусы). Для капсида альфавирусов свойствен икосаэдральный тип симметрии. Род флявивирусов включает 57 вирусов, из них ряд вирусов, имеющих значение в вет. и мед. патологии,— энцефалитов клещевого, энцефаломиелита овец, омской геморрагич. лихорадки, лихорадок жёлтой, К роду рубивирусов относятся возбудители краснухи и, возможно, артерита лошадей, к роду пестивирусов — возбудители диареи коров (комплекс), лихорадки свиней (. Классическая чума свиней),

Вирусная диарея крупного рогатого скота

Остро протекающая контагиозная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, диареей, ринитом, эрозийноязвенным воспалением слизистых пищеварительного тракта. Заболевание установлено в 1946 г. Ольсороном и сотрудниками в США. Возбудитель: РНКсодержащий вирус, относится к сем. Togaviridae, роду Pestivirus; имеет сферическую форму (Гиллепси, 1961 г.). Вирус сохраняется годами при — 20°С, в культуральной жидкости не теряет биологическую активность до 1 года, в крови, в лимфатических узлах, селезенке и др. патологическом материале — до 6 мес. При температуре 25°С в течение 1 сут вирус практически не снижает биологическую активность, при 37°С погибает через 5 сут. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину и дезоксихолату натрия. Эпизоотология. Течение и симптомы. Восприимчивы: телята в возрасте от 6 мес до 2 лет. Инкубационный период: 6—9 суток. Источник инфекции: больные животные и вирусоносители. Пути передачи: алиментарный, через обслуживающий персонал. Симптомы: при остром течении температура повышается до 40—42°С, депрессия, потеря аппетита, истечение из носа, эрозии и язвы на слизистой носовой полости, изъязвления кожи на венчике, кал зловонный, жидкой консистенции, с пеной и слизью; гибель на 2—3 сутки. У коров и молодняка старшего возраста — абортивная форма. Патолого-анатомические изменения. Обнаруживают подкожные студенистые отеки, гиперемию легких, участки уплотнения красного цвета, окруженные зоной эмфиземы. Слизистая трахеи, бронхов и бронхиол гиперемирована и покрыта слизистогнойным экссудатом. Между долями легкого иногда находят фиброзную ткань. Отмечают также отечность, гиперемию или некроз заглоточных, шейных, бронхиальных и средостепенных лимфоузлов. Диагностика. В лаборатории проводят РП в агаровом геле, РН в культуре тканей, иммунофлюоресценцию, биопробу на телятах. От больных животных в ранней'стадии болезни отбирают кровь, смывы с носовой полости, фекалии, от вынужденно убитых или павших животных направляют часть различных отделов кишечника, носовой перегородки трахеи, легких, селезенки, лимфоузлы; от абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных органов, околоплодную жидкость. Дифференциальная диагностика. При диагностике вирусной диареи необходимо исключить чуму, злокачественную катаральную горячку, ящур, инфекционный ринотрахеит, парагрипп3, аденовирусную, реовирусную, коронавирусную инфекцию крупного рогатого скота, паратуберкулез, некробактериоз (см. выше). Профилактика и лечение. Лечение: средства специфической терапии не предложены, проводят симптоматическое лечение. Профилактика: рекомендуется убой больного скота и проведение ограничительных мероприятий.

62. Получение крови у лабораторных животных.В диагностической работе бактериологических лабораторий часто приходится прибегать к заражению так называемых лабораторных, или опытных, животных. Чаще всего в повседневной практике применяют для этой цели мелких, наиболее дешевых, животных: белых мышей и крыс, морских свинок, кроликов, а из птиц-голубей и кур. Реже используют собак и кошек, еще реже — различные виды сельскохозяйственных животных. Цель биологических методов исследования заключается в определении патогенности или степени вирулентности исследуемого материала, выделении из материала чистых культур микробов, отделении патогенных микроорганизмов из смеси с сапрофитными видами и т. д. Широкое применение находят лабораторные животные и в серологической практике: морские свинки — для получения комплемента, кролики (овцы, телята) — при изготовлении различных агглютинирующих сывороток, гемолизина, эритроцитов и т. п. Для изготовления специальных питатель­ных сред от животных получают кровь, сыворотку, различные органы, ткани и т. д. Кроме того, лабораторные животные широко используются при определении качеств биологических и химиотерапевтических препаратов, а также научно-экспериментальной работе. Лабораторные животные служат так­же для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических ин­фекционных процессов, установления вирулентности и токсигенности изучаемых штаммов микробов, определения актив­ности приготовленных вакцин и исследования их на безвред­ность.

Взятие крови в больших количествах:

-путём пункции из сердца. Дают наркоз, фиксируют в спинном положении, проводят прокол (в 3-4 межреберье), на глубину 1,5-2 см, если игла попадает в желудочек из иглы бьёт струя крови, её направляют в пробирку.(кролик-200мл, морск.свин. 15-20)

- Из ярёмной вены и сонной артерии. Фиксируют на доске спиной вверх, вскрывают сосуды или накладывают 2ве лигатуры, разрезают между ними вену, сосуд опускают в пробирку, снимают лигатуру и собирают кровь.

-Из бедренной артерии. Дают наркоз, фиксируют на спине, на внутренней поверхности бедра кожу рассекают и вводят иглу в вену.

-Из подкожной вены. Дают наркоз, фиксируют на спине, и в подмышечной области разрезают кожу и сосуды. Кровь собирают из «кормашка» в пробирку.

Взятие крови в малых количествах:

-Из краевой вены уха. Растирают ухо ксилолом или эфиром и делают вкол по направлению к голове, можно надрезать ухо лезвием. Кровь собирают в пробирку.

-Из хвостовой вены: натирают хвост ксилолом и обрезают кончик.

-Из ретро-бульбарного сплетения. Животное фиксируют спиной вверх, передавливают сосуды шеи, при этом глаза выходят из арбит, после этого производят прокол пастеровской пипеткой во внутренний уголок глаза за глазное яблоко, по направлению к гортани, кровь поступает в пипетку. Животное остаётся живым и зрячим.

63. Методы, получения различных компонентов крови от лабораторных животных. Получение сыворотки. Кровь после взятия около часа вы­держивают в теплом месте (30...35°С), затем сгусток ее обводят металлической палочкой (отделение сгустка от стенок сосуда) и ставят на ночь в холодильник. Сыворотку отса­сывают пипеткой с помощью груши, переносят в стерильный со­суд, фильтруют через асбестовые фильтры "СФ" и консервируют (метриолят натрия, тимол, азид натрия и др.).

Получение эритроцитов. Вначале готовят дефибринированную кровь. Для этого в стерилизованную сухим паром толсто­стенную банку со стеклянными бусами берут кровь и постоянно встряхивают, не давая ей свернуться. По окончании кровопуска­ния банку с бусами продолжают встряхивать еще 10 мин. Полу­ченную таким образом дефибринированную кровь фильтруют че­рез 2 слоя марли в центрифужные пробирки, центрифугируют 10...15 мин при 1500..-2000 об/мин, плазму крови отсасывают пи­петкой, к осадку эритроцитов доливают физиологический рас­твор, хорошо все перемешивают и снова центрифугируют. Эрит­роциты от сыворотки отмывают не менее трех раз до получения прозрачной надосадочной жидкости и до использования сохраня­ют в холодильнике (3—5 дней). Дополнительно в качестве стабилизирующих растворов от предотвращения свертывания крови можно использовать гепарин и др.

Получение взвеси лейкоцитов.

Метод Рабино

К зо мл полученной крови добавляют 0,003 г гепарина, помещают в термостат на 30 мин в наклонном состоянии для оседания эритроцитов, затем поверхностный слой (беловатого цвета) собирают в пробирку и центрифугируют при 1500 оборотов в минуту – 2 мин. Лейкоциты оседают на дно, прозрачную жидкость сливают, к осадку добавляют 5 мл физ. Раствора и дважды в нём отмывают.

Метод Ванцетти-Каудиани

К 6 мл крови добавляют 1,5 мл 3% извести гуммарабики, добавляют 1,5 мл нитрата натрия – взбалтывают и оставляют на 30 мин до полного оседания эритроцитов. Поверхностный светлый слой снимают пипеткой в центрифужную пробарку и центрифугируют при 1000 оборотов в мин – 3 мин. Лейкоциты оседают на дне. Прозрачную жидкость сливают, к осадку добавляют 5 мил физ раствораи дважды в нём отмывают.

64. Сплит-вакцины, методы получения. Вакцины из расщеплённого вириона (сплит) после обработки эфира содержат осколки разрушенных вирусных частиц (АГ + баластные примеси).При обработке вирионов этиловым эфиром удаляются липиды.

3 метода получения:

1. получаем большое количество вирусов, их выделяют и получают, имунногенные субъединицы – сплит-вакцины (дорогой способ).

2. Химический синтез специфического иммуногена, но для этого над знать структуру и амминокислотный состав Аг. После их синтеза их соединяют белком носителем. Затем эту смесь используют в качестве вакцины.

3. Генная инженерия. Установлена у отдельных вирусов. Мозаичность генов, т.е. гены кодируются определённый белок имеют вставки, которые не имеют отношения к синтезу белка. Чтобы ген-инфекция реализовалась, вставки вырезают специальными ферментами. Генноинженерные вакцины получают с помощью биотехнологий.

4. 65. Вирус алеутской болезни норок Алеутская болезнь (вирусный плазмоцитоз) — контагиозная болезнь норок, характеризующаяся распространенной плазмоклеточной пролиферацией (плазмоцитоз), гипергаммаглобулинемией, явлениями геморрагического диатеза, артериитом, гепатитом, анемией и прогрессирующим истощением зверей.Возбудитель болезни — вирус, относящийся к семейству ParvoviridaeПомимо комплексов вирус—антитело в организме норок, очевидно, формируются комплексы другого рода, в состав которых входят ДНК и антитела к ДНК, денатурированные белки и антитела к ним.Вирус устойчив к воздействию формалина, эфира и высокой температуры. Формальдегид в 0,3%-ной концентрации при экспозиции 2 нед не инактивирует вирус. Последний в гомогенатах сохраняет патогенные свойства при прогревании 80 °С в течение 1ч, 90...95 "С — в течение 15...30 мин. Растворы щелочей и йода (0,5%-ные), глутарового альдегида (2%-ный), ультрафиолетовые лучи действуют на вирус губительно. При низких температурах он не теряет активности в течение 1 года.

5. Эпизоотология В естественных условиях к вирусу алеутской болезни восприимчивы норки всех окрасок, однако особи с гомозиготным рецессивным геном АА (алеутские, сапфировые, голубые) заболевают чаще, быстрее и тяжелее переносят болезнь, чем стандартные. Генетические факторы влияют на тяжесть заболевания, но не на восприимчивость. Источником возбудителя инфекции служат больные норки и вирусо-носители, которые выделяют вирус со слюной, мочой, калом, молоком, околоплодной жидкостью. Заражение происходит алиментарно, аэрогенно, внутриутробно, через поврежденную кожу. Определенное значение имеет распространение вируса через предметы ухода, корма и блохами. В свежем очаге инфекции преобладает прогрессирующая форма, в стационарном — бессимптомная.

6. Течение и клиническое проявление. Клинические признаки болезни обнаруживают незадолго до гибели животного через 1...24 мес после заражения. Самые характерные из них — это прогрессирующее исхудание, периодическое кровотечение из носа и рта, усиливающаяся жажда, анемия, лихорадка. Зверьки малоподвижны, у них сонливый вид, волосы взъерошены, тусклые, линька задерживается. Кончик носа и подушечки пальцев приобретают желтый цвет. Начинается диарея, фекалии дегтеобразные. развиваются парезы и параличи. У самок, заразившихся до периода гона, типичными считают аборты, пропустование, рассасывание плодов, потерю материнского инстинкта..Прогноз болезни неблагоприятный. При бессимптомной форме погибает до 20 % норок. При прогрессирующей — в течение первого года после заражения — более 50 %, а на второй год — до 80 %. Гибель зверей наступает через 2...7 мес, иногда на 675-й день после заражения.

7. Наиболее характерны патологоанатомические изменения в почках. В почках явления нефрозонефрита. Печень увеличена в 2 раза, цвета красного дерева или мускатного ореха. Селезенка резко увеличена — в 2...5 раз, пятнистая. Лимфатические узлы набухшие, сочные. Гистологические изменения весьма характерны. В почках, печени, селезенке, костном мозге, лимфатических узлах находят явления плазмоци-тоза. Плазматические клетки располагаются диффузно или очагами. Плазмоклеточную очаговую и диффузную пролиферацию можно обнаружить в любой ткани, но чаще поражаются органы кроветворения.

8. Диагностика и дифференциальная диагностика. Диагноз ставят на основании анализа эпизоотологических данных, клинической картины и результатов патологоанатомического и лабораторного (серологического) методов исследования.

9. Разработано несколько видов серологических реакций: реакция имму-нофлуоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ELISA), тимоловая проба, реакция йодной агглютинации, проба мочи на белок Бенс-Джонса, реакция иммуноэлектроосмофореза. В настоящее время для диагностики болезни широко применяют также ИФА и ПЦР.

10. Реакция иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ) широко применяется и служит основным методом прижизненной диагностики алеутской болезни норок, так как отличается высокой специфичностью, позволяя выявлять до 98 % больных через 6... 15 дней после заражения. Все инфицированные норки гибнут, поэтому говорить о естественном иммунитете не приходится.