2. Выявление бактериофагов из различных объектов внешней среды и определение его титра. Реакция нарастания титра бактериофага и ее применение.

Выявить бактериофаги можно при нанесении содержащего их материала на плотные питательные среды, засеянные чувствительной бактериальной культурой, на которой появляются зоны лизиса бактерий — бляшки (стерильные пятна, негативные колонии). Число этих бляшек соответствует количеству Б. в материале — титру Б. Титровать Б. можно на жидких (по Аппельману) и твердых (по Грациа) питательных средах. Важным свойством фагов, на котором основана фагодиагностика, является их специфичность: они лизируют культуры определенного вида, более того, существуют так называемые типовые бактериофаги, лизирующие варианты вида бактерий.

Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл мясо-пеп-тонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносят во 2-ю, из 2-й — в 3-ю и т. д. до 10-й включительно. Из 10-й пробирки лишние 0,5 мл выливают; 11-я и 12-я пробирки контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получают разведения бактериофага от 1 : 10 до 1 : 20. Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 0,2 мл 18—24-часовой бульонной культуры бактерий, одноименных титруемому фагу.

3. Полимеразная цепная реакция (пцр).

Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.

Необходимо подчеркнуть, что обязательным условием проведения полимеразной цепной реакции является знание нуклеотидной последовательности того или иного объекта исследования (вирус, бактерия и др.). В настоящее время в банках данных имеются практически полные сведения о геноме различных патогенных микробов.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К.Мюллисом . В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарности, который является маркерным для данного вида возбудителя. In vivo ПЦР включает несколько стадий:

1. Денатурация ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК.

3. Синтез новой цепи ДНК.

При многократном повторении циклов репликации происходит увеличение числа копий фрагмента ДНК. Все это позволяет из единичных клеток микроорганизмов, содержащихся в анализируемом биологическом материале, получить необходимое количество ДНК для их идентификации.

Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой молекулы ДНК. При этом 3'концы этих синтетических олигонуклеотидов должны быть направлены навстречу друг другу.

Таким образом, полимеразная цепная реакция — это многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидфосфатов, солевого буфера и нуклеотидных праймеров, определяющих границы синтезируемого участка. Полученную смесь прогревают в течение 1 мин при 94 °С, при этом комплементарные нити ДНК разъединяются. Этот этап называют денатурацией ДНК («плавлением»).

Затем температуру снижают до 45 — 65 °С (в зависимости от состава олигонуклеотидов) и выдерживают ее 1,0—1,5 мин. При этом к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3'концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5'концу. Этот этап называют «отжигом». На третьем этапе поддерживается температура 72 °С. Это оптимальная температура для работы применяемой в ПЦР полимеразы. Данный фермент, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, содержащиеся в смеси, достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3 концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется «элонгация» (удлинение).

Циклическое повторение трех приведенных температурных режимов выполняется с помощью автоматических устройств — термоциклеров (амплификаторов).

Как правило, проводится 30 циклов, что теоретически позволяет получить 230 копий участка ДНК возбудителя.

ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.