Частота излучения молекулами света ν будет определяться формулой:

ν = (Е_m-Е_n) /h = (Е_m(эл.)-Е_n(эл.))/ h +( Е_m(кол.) - Е_n(кол.))/h+( Е_m(вр.)-Е_n(вр.))/h

Различие в энергии между наиболее низким и первым возбужденным состояниями составляет 2-10 эВ (1 эВ равен 1,602^.10^-19 Дж) для энергий электронного движения; 0,2-2 эВ ‑ для колебательных энергий и 10^-5-10^-3 эВ – для вращательных энергий.

Спектральные линии испускания и поглощения, соответствующие электронным переходам, обычно расположены в самой близкой инфракрасной, видимой и ультрафиолетовых областях спектра (λ=0,1÷1 мкм). Линии соответствующие колебательным переходам, лежат в близкой инфракрасной области спектра (λ=1÷50 мкм), а линии чисто вращательного спектра расположены в далекой инфракрасной области спектра (λ=50÷2000 мкм).

Основные компоненты пищевых систем представляют собой сложные органические соединения, поглощательные, излучательные, преломляющие свойства которых определяются в основном специфическими особенностями их состава, структуры, а также характером химической связи.

Присутствие в них таких функциональных групп, как –N=N‑, ‑HC=CH‑, =C=O, ‑C=C‑ и др. вызывает поглощение в ближней ультрафиолетовой и видимой областях. Такие ненасыщенные группы называются хромофорными.

Некоторые группы усиливают поглощение, хотя сами не поглощают в данной области спектра (например, NH₂‑OH), они называются ауксохромными.

Наличие в молекулах анализируемых веществ сопряженных (конъюгированных) связей оказывает значительное влияние на характер спектров поглощения. Происходит смещение полос поглощения в длинноволновую область спектра с одновременным увеличением интенсивности.

Например, при окислении полиненасыщенных жирных кислот образуются конъюгированные изомеры, поглощающие в области длин волн 230-260 нм. β-каротин, который имеет восемь двойных сопряженных связей, обладает сильным поглощением в видимой области при 420-480 нм, в то время как витамин А, который образуется при расщеплении β-каротина по центральной двойной связи, поглощает только в ближней ультрафиолетовой области.

Спектрофотометрия

При взаимодействии электромагнитного излучения с веществом всегда имеет место соотношение, выражающее закон сохранения энергии, падающей на вещество в единицу времени, т.е. падающий поток излучения Φ_о равен сумме поглощенного Φ_а, отраженного Φ_r и пропущенного веществом потока Φ_т:

Φ_о = Φ_а + Φ_r + Φ_т или A+ R + T =1

R = Φ_а/Φ_о – коэффициент поглощения;

R = Φ_r /Φ_о ‑ коэффициент отражения;

Т = Φ_т/Φ_о – коэффициент пропускания.

При прохождении через однородную среду монохроматографического луча света ослабление интенсивности светового потока описывается законом Бугера:

Φ_λ = Φ_оλ exp(-xl) или T_λ = exp(-x_λl),

где Φ_оλ и Φ_λ – соответственно интенсивности падающего и прошедшего через анализируемый слой (l) вещества света при монохроматической длине света (λ).

х_λ ‑ показатель поглощения.

Объединенный закон Бугера-Ламберта-Бера устанавливает следующую зависимость:

Φ_λ = Φ_оλ exp(-x_оλcl),

где с ‑ концентрация вещества, моль/л;

l ‑ толщина исследуемого слоя вещества, см.

Логарифм величины обратной пропусканию носит название погашения (экстинции) или оптической плотности D:

xcl.

Графическая зависимость «D-с» представляет собой прямую линию, проходящую через начало координат. Методом экстраполяции определяют концентрацию анализируемого вещества на градуировочной прямой (D-С).

Применяют также метод добавок.

При соблюдении основного закона светопоглощения при постоянной толщине слоя отношение оптических плотностей исследуемого раствора и исследуемого раствора с добавкой будет равно отношению их концентраций:

D_х/D_{х + а} = С_х/(С_х+С_а), откуда:

С_х = С_аD_х/(D_{х + а}-D_х),

где D_х - оптическая плотность исследуемого раствора;

D_х+а – оптическая плотность исследуемого раствора с добавкой;

С_х – неизвестная концентрация определяемого вещества в исследуемом растворе;

С_а ‑ концентрация добавки (С_доб.) она связана соотношением:

С_а = С_добV_доб/V_{x +a}

Добавки следует брать в таких количествах, чтобы не происходило «потери точности при вычитании»; минимальная разность D_х+а-D_х должна быть не менее 0,1.

При большом солевом фоне, особенно когда примеси взаимодействуют с реагентом, метод добавок может привести к получению завышенных результатов, из-за отклонений от закона Бугера-Ламберта-Бера.

Приборы, используемые для измерения светопоглощения фотоэлектроколориметры, спектрофотометры, принцип работы которых заключается в преобразовании световой энергии в электрическую с помощью фотоэлементов (явление фотоэффекта).

Спектрофотометры с автоматической запись спектров поглощения позволяют непосредственно получить зависимость D от λ.

По спектру определяют длину волны максимального поглощения.

Большое число методик фотометрического анализа посвящено также определению микроэлементов (Fe, Ni, Co, Zn, Pb, Mo и т.д.), основанных на предварительном получении окрашенных комплексных соединений с такими реагентами, как дитизон, роданид аммония, диметилглиоксим, ферроцианид калия и др.

Нижний предел обнаружения составляет n·10^-5 моль/л.

_макс λ, нм

Рис.10. Спектр поглощения