9.2.2. Выделение генов из смеси рестрикционных фрагментов геномной днк

Для выделения нужного гена из смеси рестрикционных фрагментов используют меченые зонды – фрагменты ДНК, комплементарные искомым генам (целиком или отдельным их частям). Зонды метят с помощью радиоактивного фосфора или хемилюминесцентных меток. В основе метода лежит свойство одноцепочечных молекул ДНК соединяться (гибридизоваться) в случае их комплементарности.

Для перевода молекулы ДНК в одноцепочечную форму ее подвергают тепловому воздействию или обработке щелочью. В этих условиях водородные связи между основаниями разрываются и цепи расходятся (процесс денатурации ДНК). Если теперь медленно снизить температуру, то произойдет их восстановление (ренатурация). Однако если при этом в растворе присутствует одноцепочечный ДНК-зонд, он тоже будет ренатурировать с ДНК, специфически связываясь с комплементарными участками.

Нужный ген может быть выделен или до, или после процедуры клонирования в E. coli смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК. В первом случае фрагменты ДНК, полученные после обработки рестриктазами, разделяют в соответствии с их размерами с помощью электрофореза в агарозном геле. Поскольку проводить описанные выше процедуры гибридизации ДНК с зондами в геле невозможно, ДНК после электрофореза переносят на более подходящие для этих целей носители: нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны. Фрагменты ДНК прочно связываются с ними и не могут изменять свое положение, например из-за диффузии. Процедуру переноса фрагментов ДНК с агарозного геля на нитроцеллюлозные мембраны и проведения гибридизации с зондами разработал Э. Саузерн [Sauthern, 1975] (Рисунок 9. ). Благодаря простоте и высокой эффективности этот метод нашел широкое применение в генно-инженерных исследованиях. Его название - Саузерн-блоттинг стало нарицательным. Два других аналогичных метода, в которых используются РНК и белки получили названия соответственно нозерн-блоттинг (северный блоттинг) и вестерн-блоттинг (западный блоттинг), что является игрой слов (Саузерн (southern) – южный).

Саузерн-блоттинг проводят следующим образом (рисунок 9.7). Двунитчатую ДНК на агарозном геле денатурируют, чтобы образовались однонитчатые молекулы, с помощью NaOH. Затем агарозный гель помещают на влажную губку, расположенную в кювете с раствором щелочи, сверху кладут нитроцеллюлозный фильтр, затем несколько слоев сухой фильтровальной бумаги и весь этот сэндвич прижимают грузом. Сухая фильтровальная бумага начинает втягивать влагу из расположенных ниже слоев. Создается поток щелочи снизу вверх из губки через гель, нитроцеллюлозную мембрану к фильтровальной бумаге. Этим потоком фрагменты ДНК вымываются из геля и закрепляется на нитроцеллюлозе именно в той последовательности, как они расположились после электрофореза. Однонитчатые фрагменты ДНК фиксируют на нитроцеллюлозной мембране с помощью нагревания. На ней и проводят гибридизацию с меченым ДНК-зондом.

В случае если зонд находит комплементарный ему фрагмент ДНК, происходит их связывание. Местоположение связавшегося зонда определяют, приложив к нитроцеллюлозной мембране рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. Засвеченные участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки. При использовании хемилюминисценных меток их местоположение определяют в ультрафиолетовом или лазерном свете.

Для того чтобы выделить нужный фрагмент ДНК, повторно проводят электрофорез рестрикционных фрагментов ДНК, или берут второй гель, если электрофорез проводился одновременно в двух гелях. Этот гель, который не подвергался ДНК-ДНК гибридизации, имеет интересующий сегмент в том же месте, что и в проанализированном с помощью ДНК-зонда геле. Сегмент вырезают из геля и извлекают из него ДНК, которую можно далее клонировать, как это было описано выше.