Дополнительная литература

1. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев.: Наукова думка. 1984.- 160 с.

2. Яковлева Г.А. Cоматическая гибридизация и клеточная селекция картофеля (Solanum tuberosum L.)/ Генетические основы селекции растений. В 4 т. Т.3. Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия/науч. ред. А.В. Кильчевский, Л.В. Хотылева. – Минск: Беларус. Наука, 2012. С.217-250.

3. Orczyk W., Prztakiewicz J., Nadoloska-Orczyk A. Somatic hybrids of Solanum tuberosum – application to genetics and breeding//Plant Cell Tissue Organ Cult. 2003. V.74. P 1-13.

Заключение

Наиболее эффективным методом расширения генетической основы селекционного материала является гибридизация его с дикими и примитивными культурными родственными видами (отдаленная гибридизация). Однако во многих случаях скрещивания между культурными и дикими видами связаны со значительными проблемами, вызванными естественными межвидовыми барьерами. Наиболее существенными барьерами являются геномные различия между видами, различия в плоидности, барьеры, препятствующие гибридизации (пре- и постзиготные репродуктивные барьеры). Для их преодоления разработаны специальные приемы, основанные, в том числе, на применении методов культуры клеток и протопластов in vitro.

Опыление in vitro используют, прежде всего, для преодоления презиготной несовместимости при межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. Метод включает: обнажение семяпочки или семяпочек путем удаления тканей пестика и завязи, нанесение на них пыльцы и культивирование оплодотворенных семяпочек на питательной среде до образования зрелых семян. Было предложено несколько вариантов метода: опыление и культивирование изолированных завязей, семяпочек, прикрепленных к плаценте, семяпочек без плаценты. Подобно оплодворению в пробирке у животных, удалось добиться выделения и слияния in vitro единичных женских и мужских гамет и регенерации из продуктов слияния растений (Kranz, Lorz, 1993). Был разработан метод химического слияния гамет (с помощью CaCl₂), который обеспечивал высокую частоту (около 80%) слияния преимущественно женских гамет с мужскими [Faure et al. 1994]. Культура оплодотворенных завязей оказалась весьма эффективным приемом для получения межвидовых и даже межродовых гибридов в комбинациях, которые ранее не удавались из-за постгамной несовместимости (гибели зародыша на ранних стадиях развития из-за несовместимости с эндоспермом, раннего опадания плодов). С помощью этого метода были получены ценные для селекции межвидовые гибриды хлопчатника, клевера, подсолнечника.

Культура in vitro зиготических зародышей («embryo rescue» - спасение зародышей) позволяет предотвратить их гибель из-за нарушения питания, например, из-за недоразвитого эндосперма гибридного семени. Метод широко используется в селекции для целей межвидовой гибридизации риса, фасоли, томатов, картофеля, лилий, донника и других культур. Этот метод используют также при получении гаплоидов путем опыления пыльцой гаплопродюсеров, облученной пыльцой (см. 7.8), для прерывания периода покоя семян и других целей.

Зародыши вычленяют в стерильных условиях из гибридных семян, помещают их на питательную среду и при культивировании на свету добиваются регенерации из них растений. Эффективность регенерации растений в значительной степени зависит от размера эксплантата и стадии развития зародыша: чем больше эксплантат и чем более зрелый зародыш, тем выше вероятность регенерировать из него растение. Для культуры мелких зародышей на ранних стадиях развития используют обогащенные питательные среды, а также получают из них каллюс, из которого затем регенерируют растения

Использование методов соматической гибридизации путем слияния протопластов открывает новые возможности в области отдаленной гибридизации. Технология соматической гибридизации включает следующие этапы: получение суспензий протопластов двух видов растений, гибриды между которыми предполагается получить, получение смешанной суспензии протопластов двух видов и использование экспериментальных воздействий (химических или электрических), обеспечивающих слияние протопластов, отбор продуктов слияния, получение из них каллюсной культуры и регенерация растений соматических гибридов, подтверждение их гибридности.

Изолированные протопласты, как правило, являются одноименно (отрицательно) заряженными частицами. Поэтому для того, чтобы они сблизились и произошло слияние протопластов разных видов, в питательную среду к суспензии протопластов добавляют определенные вещества («фьюзогены» от англ. fusion - слияние) или суспензию подвергают воздействию электрического тока. Наибольшее распространение получили следующие системы слияния протопластов: высокая концентрация в среде ионов Ca²⁺ (около 50 мМ) и высокая рН (9-11) при 37^оС; добавка в среду полиэтиленгликоля (ПЭГ); сочетание ПЭГ + высокая концентрация ионов Ca²⁺ и высокая рН.

Электрослияние протопластов осуществляют в специальной кювете прибора с двумя электродами. Через питательную среду, в которую помещают суспензию протопластов двух видов, пропускают высоковольтные импульсы. Параметры электрического поля и продолжительность его действия в каждом случае подбирают экспериментально. Под действием тока на электродах образуются агрегаты из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5-6 протопластов между электродами. В это время на электроды подают единичные импульсы постоянного тока, которые приводят к образованию пор в сильно сжатых мембранах протопластов. В результате происходит перемешивание цитоплазмы контактирующих протопластов и образуются гибридные протопласты.

Поскольку существующие методы обеспечивают высокую частоту слияния протопластов, можно получить большое количество растений-регенерантов и проводить отбор гибридов на организменном уровне. Однако во многих случаях гибриды сложно отличить от родительских форм, поэтому их отбор рекомендуется проводить на уровне клеток, применяя следующие подходы. Механическая изоляция: используют морфологически различные типы родительских протопластов, например, протопласты из каллюсных клеток и мезофилла листа. После слияния гибридные протопласты выявляют визуально под микроскопом, изолируют микропипеткой и с помощью микроманипулятора переносят в отдельную каплю обогащенной питательных среды. Генетическая комплементация: если слить протопласты мутантов, гомозиготных по разным рецессивным генам, полученные соматические гибриды в силу гетерозиготности по этим генам будут иметь фенотип дикого типа (нормальный). Отбор гибридов проводят на клеточном уровне или среди растений-регенерантов. Для целей соматической гибридизации растений чаще всего используют генетическую комплементацию с участием хлорофилл дефектных мутантов, которые нередко специально для этого получают, а также ауксотрофных мутантов. Физиологическая комплементация основана на способности гибридных клеток делиться и переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки, или клетки одного из родительских видов этого делать не в состоянии. При этом неспособность родительских культур клеток к росту и морфогенезу не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является их нормальной физиологической реакцией на условия культивирования. Инактивация протопластов одного из родителей до слияния протопластов ионизирующим излучением или биохимическими ядами, необратимо подавляющих метаболизм клетки. В гибридных клетках способность к делению и морфогенезу в культуре in vitro восстанавливается. Физическое обогащение заключается в разделении протопластов после слияния с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Физическое обогащение позволяет повысить эффективность других методов селекции, например, генетической комплементации.

В результате слияния протопластов двух видов растений могут быть получены соматические гибриды, у которых полностью представлены геномы обоих родительских видов (симметричные гибриды), полностью сохраняется геном только одного из видов и отдельные хросомосомы второго вида (асимметричные гибриды), геном одного из родителей, а также ДНК пластид и митохондрий обоих родителей, либо родителя, хромосомы которого утрачены (цибриды или цитоплазматические гибриды). Полученные соматические гибриды подлежат обязательному изучению: проводят исследование морфологических признаков, оценку селекционной ценности гибридов, анализ изоферментов, различных ДНК-маркеров, применяют цитогенетические методики, например, метод геномной in situ гибридизации (GISH).

Получение соматических гибридов является лишь первым шагом в интрогрессии генофонда диких видов в селекционный материал, так как первичные гибриды требуют последующей селекционной доработки путем беккроссирования культурным видом. Во многих случаях беккроссирование соматических гибридов сильно затруднено. Соматические гибриды могут представлять собой аллополиплоиды, у которых из-за значительных геномных различий родительских видов происходит конъюгация преимущественно между гомологичными хромосомами. Интрогрессия ценных генов от дикого вида культурному при использовании таких гибридов в основном возможна путем получения трисомных, тетрасомных, или замещенных по отдельным хромосомам линий.

Соматические гибриды в большинстве случаев несут факторы пре- и постзиготной межвидовой несовместимости (пре- и постзиготные межвидовые барьеры), характерные для родительских видов. Увеличение дозы геномов культурного родителя у таких соматических гибридов позволяет их ослабить и получить в результате беккроссное потомство в скрещиваниях с культурным видом. Однако эффективность интрогрессии ценного генофонда диких видов в селекционный материал при использовании высоко полиплоидных соматических гибридов требует достаточно длительное время для снижения уровня плоидности селекционного материала до уровня плоидности культурного вида, отбор по селекционно-ценным признакам проводится среди полиплоидного и анеуплоидного селекционного материала, для которого характерно сложное расщепление. Для того, чтобы обойти или преодолеть факторы межвидовой несовместимости, сохраняющиеся у соматических гибридов, предлагается ряд подходов, позволяющих добиться расщепления по этим факторам: использование, если это возможно, соматических гибридов в качестве опылителей в скрещиваниях с культурным видом, снижение их плоидности с помощью гаплопродюсеров или культуры пыльников.